Posterbeitrag auf dem Internationalen Lebensmittelchemikertag, Freiburg 1996

Gewinnung multispezifischer Antikörper zur Immunaffinitätschromatographie von Penicillinrückständen



, Michael Petz

Bergische Universität - GH Wuppertal
Fachbereich 9 - Lebensmittelchemie, 42097 Wuppertal


1. Einführung

Nach Kopplung an ein Protein lassen sich auch für niedermolekulare Substanzen Antikörper gewinnen, z.B. gegen Mykotoxine oder Antibiotika, wenn Kaninchen oder andere Tiere in geeigneter Weise immunisiert werden. Diese Antikörper können als hochselektive Reagentien in der Rückstandsanalytik verwendet werden, indem man sie für Immunoassays einsetzt oder für die Immunaffinitätschromatographie (IAC) an ein Trägermaterial koppelt.

Die IAC ist ein äußerst leistungsfähiges Verfahren zur Abtrennung und Konzentrierung von Rückständen aus Lebensmittelextrakten und kann das auf traditionellem Wege meist äußerst arbeits- und zeitaufwendige Cleanup bei physikalisch-chemischen Spurenanalysen auf wenige Schritte begrenzen. Eine IAC-Säule läßt sich off-line mit verschiedenen Detektionsverfahren verknüpfen oder auch on-line koppeln, so daß Cleanup, HPLC-Trennung und Detektion z.B. von Penicillinen vollständig automatisiert ablaufen können [1].

Wegen der stark individuell geprägten Reaktionen der Versuchstiere ist das Ergebnis einer geplanten Antikörperherstellung jedoch nicht vorhersagbar und muß weitgehend nach dem "trial and error"-Prinzip erfolgen. Mit dem Ziel Antikörper zu gewinnen, die gegen die ganze Gruppe der Penicilline spezifisch sind, wurden Kaninchen und Legehennen immunisiert und Serum bzw. Eidotter aufgearbeitet [2].


2. Herstellung der Antikörper

Penicilline alleine können keine Immunantwort auslösen und müssen daher an ein Trägermolekül gebunden werden. Zur Gewinnung von multispezifischen Antikörpern wurde als Hapten das Grundgerüst der Penicilline, die 6-Aminopenicillansäure, ausgewählt. Die einzelnen Penicilline unterscheiden sich durch die Substitution an der 6-Aminofunktion.
Als Trägermolkül wurden Ovalbumin (OVA) oder keyhole limpet hemocyanin (KLH) verwendet. Wichtig war, daß bei der Immunogensynthese als immunogenes Epitop das kondensierte Ringsystem aus beta-Lactam- und Thiazolidinring nach außen gerichtet war und daß der beta-Lactamring nicht geöffnet wurde. Beide Voraussetzungen wurden von den nach dem gezeigten Schema synthetisierten Immunogenen erfüllt. Mit den so gewonnenen Immunogenen wurden 3 Kaninchen (OVA- und KLH-Immunogene) sowie 5 Legehennen (nur KLH-Immunogen) immunisiert [1, 2].



3. Charakterisierung der Kaninchenantikörper [1]

Die Titerfaktoren im Kaninchenserum lagen nach der 5. Boosterinjektion (am 119. Tag nach der Erstimmunisierung) nicht sehr hoch (Tabelle). Daher wurden die Immunisierungen ausgesetzt und nach einigen Wochen wieder aufgenommen. Diese Maßnahme hat in der Vergangenheit bei der Immuniserung von Kaninchen zur Erhöhung des Antikörpertiters geführt. Nach 14 Boosterinjektionen (276 Tage nach der Erstimmunisierung) war jedoch keine Erhöhung der Titerfaktoren zu erkennen.
Im Gegensatz zum Titer hat sich nach der Wiederaufnahme der Immunisierung die Spezifität geändert. Während vor der Immunisierungsunterbrechung multispezifische Antiseren gewonnen werden konnten, hatten sich nach der Wiederaufnahme der Injektionen benzylpenicillinspezifische Antiseren entwickelt. (Abbildung). Alle drei Kaninchen zeigten dieselbe Reaktion.


119. Tag 276.Tag
6-APA-OVA 1 50 25
6-APA-OVA 2 70 65
6-APA-KLH 180 200



4. Charakterisierung der Dotterantikörper [1, 2]

Legehennen reichern ihre Antikörper in den Eidottern an, so daß zur Antikörpergewinnung keine Blutabnahmen erforderlich sind. Es wurden fünf Tiere immunisiert, die über den Immunisierungszeitraum in den Dottern den dargestellten Titerverlauf zeigten (Abbildung unten).
Die Spezifität der Antikörper veränderte sich bei einigen Hennen über den Immunisierungszeitraum (in der Abbildung ganz unten exemplarisch für Tier A gezeigt), Tier D bildete keine Antikörper mit befriedigender Kreuzreaktivität.


5. Immunaffinitätschromatographische Reinigung der Dotterantikörper

Die Globulinfraktion der Eidotter wurde durch Fällung mit Polyethylenglykol (PEG) von den Lipoproteinen getrennt [3] und anschließend durch Ultrafiltration vom Fällungsreagenz befreit. Zur affinitätschromatographischen Isolierung der anti-6-APA-Antikörper wurde 6-Aminopenicillansäure über die 6-Aminofunktion an einen mit Carbonyldiimidazol aktivierten Träger gekoppelt. Die spezifischen Antikörper eluierten in zwei Fraktionen. Die erste spezifische Fraktion hatte einen höheren Antikörpertiter sowie eine um den Faktor 10 höhere Affinität zu Benzylpenicillin und Ampicillin als die zweite Fraktion [1, 2].


6. Stabilität der Dotterantikörper

Die Stabilität der Dotterantikörper unter verschiedenen Bedingungen ist in der Tabelle zusammengefaßt.

Lösung der Antikörper in: Temperatur Stabilität
Eidotter 4 °C Jahre
Phosphatpuffer pH 7,2 nach Polyethylenglykolfällung (PEG nicht entfernt) 4 °C mindestens mehrere Wochen
Phosphatpuffer pH 7,2 nach Polyethylenglykolfällung (PEG entfernt) 4 °C mindestens mehrere Wochen
Phosphatpuffer pH 7,2 nach Affinitätschromatographie 4 °C 2 - 4 Tage
Phosphatpuffer pH 7,2 nach Affinitätschromatographie - 20 °C mindestens mehrere Wochen

Die mangelnde Haltbarkeit der Antikörper in Lösung bei Kühlschranktemperatur bedeutet eine Einschränkung bei der Verwendung der Antikörper in Immunaffinitätssäulen, während der Einsatz in einem ELISA problemlos sein dürfte, da die Mikrotiterplatten bei 20 °C gelagert werden können.


7. Danksagung

Unser Dank gilt




8. Literatur

[1] de Leuw P (1996) Dissertation Univ. Wuppertal
[2] de Leuw P, Kapa, G, Petz M, Schreurs FJS, Kan CA. J. AOAC Int. (1997) 80:1220
[3] Polson A, Coetzer T, Kruger J, von Maltzahn E, von der Merwe KJ (1985). Immunol Invest 14, 323



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Mai1997
Peter de Leuw PdL, , letzte Aktualisierung: 09.12.2010

http://www.pdeleuw.de/diss/poster.html - ausgedruckt am 16.10.2021