1.6 Immunisierung der Versuchstiere

Kaninchen können mit Hapten-Protein-Konjugaten subcutan, intradermal und intravenös immunisiert werden. Meistens wird die subcutane Applikationsroute gewählt, da diese am unkompliziertesten ist. Als Adjuvans wird normalerweise Freundsches Adjuvans verwendet. Die Immunogenmenge sollte zwischen 50 und 1000 g liegen. Die erste Folgeimmunisierung erfolgt am besten nach 2 - 3 Wochen, die weiteren Injektionen jedoch alle 4 - 6 Wochen. Wird früher immunisiert, wird das injizierte Immunogen teilweise von den gerade gebildeten und in hoher Konzentration im Blut zirkulierenden Antikörpern komplexiert [59].

Hühner zeigen starke individuelle Unterschiede in der Reaktion, man sollte daher mindestens 5 Hühner immunisieren [127].
In der Literatur findet man unterschiedliche Angaben zur Immunisierung von Hühnern. Die Antikörperbildung soll abhängig sein von der Größe des Antigens; Antigene mit einem Molekulargewicht von unter 150.000 Da rufen einen geringeren Antikörpertiter hervor [128]. Allein aus diesem Grunde scheint es nicht sinnvoll, ein 6-APA-OVA-Konjugat als Immunogen zu verwenden, da Ovalbumin ein Molekulargewicht von nur rund 45.000 Da besitzt. Der Antikörpertiter ist nicht konstant über eine länger Zeit, sondern unterliegt einem "Biorhythmus" [129].
Meistens wird in den Pectoralmuskel injiziert. Andere Injektionsarten werden praktiziert, sollen jedoch keinen Vorteil haben [112]. Die Antigenmengen variieren von wenigen g bis zu mehreren mg. Als Antigene werden Bakterien, Viren, Parasiten, Proteine und Peptide eingesetzt [129].
Als Adjuvans dient in den meisten Fällen Freundsches Adjuvans. Das komplette Freundsche Adjuvans (FCA), das meistens zur 1. Injektion verwendet wird, soll nach Kühlmann et al. [117] und Schade und Hlinak [112] für einen über lange Zeit stabilen Titer sorgen. Die durch FCA verursachten Nebenwirkungen sind bei Legehennen nach Literaturangaben schwach im Vergleich zu Säugetieren [112, 129]. Andererseits berichten Erhard et al. [130] von ausgedehnten Entzündungen und Granulomen an den Injektionsstellen.
Neuerdings werden auch Versuche mit synthetischen Lipoproteiden als Adjuvantien beschrieben [130, 131]. Diese stellten sich als äußerst wirksam und frei von Nebenwirkungen heraus.

1.7 Charakterisierung polyklonaler Antikörper

Antiseren können durch drei Größen beschrieben werden: den Titer, die Spezifität sowie die Assoziationskonstante.
Der Titer beinhaltet sowohl die im Antiserum enthaltene Menge an spezifischen Antikörpern als auch die Affinität der Antikörper zum Antigen bzw. Hapten. Er ist als optimale Verdünnung des Antiserums für einen Immunoassay definiert und stellt die Verdünnung dar, bei der 50 % des markierten Antigens im System gebunden werden [132]. Die Bestimmung erfolgt durch die Zugabe von konstanten Mengen markierten Antigens zu verschiedenen Verdünnungsstufen des Antiserums. Durch Auftragen des gebundenen Anteils gegen die Antiserumverdünnung in halblogarithmischer Darstellung bestimmt man die Verdünnung, die 50 % des Antigens bindet.
Diese Definition macht jedoch dadurch, daß als Bezugsgröße die angebotene Haptenmenge gewählt wird, den Titer von der Menge Hapten abhängig, die im Assay eingesetzt wird. Der Titer eines Antiserums stellt also nur bedingt ein Qualitätsmerkmal dar.
Pepper [133], van de Water [134] und de Villiers [135] umgehen diesen Nachteil, indem sie als Titer die Serumverdünnung definieren, die 50 % des maximal gebundenen Haptens bindet.
Allgemein ist der Titer abhängig von der Meßmethode. Ein Antiserum hat im Radioimmunoassay (RIA) einen anderen Titer als im Enzymimmunoassay (EIA) [97].

Die Affinität beschreibt die Bindungsstärke zwischen Antigen und Antikörper, die aus dem Massenwirkungsgesetz abgeleitet werden kann. Sie wird als Assoziations- bzw. Dissoziationskonstante ausgedrückt. Für polyklonale Seren finden sich schwerpunktmäßig Dissoziationskonstanten von 10^-8 bis 10^-6 mol/l angegeben [50], jedoch sind auch geringere Dissoziationskonstanten bekannt (z.B. 10^-10 mol/l für anti-Chloramphenicol-Antiseren [137]).

Die Bestimmung der Assoziationskonstante K_a hat Scatchard [138] für die Reaktion von kleinen Molekülen (Haptenen) mit Antikörpern mit Hilfe von Modellrechnungen beschrieben. In einem Assay werden steigende Mengen an markiertem Hapten einer konstanten Menge Antikörpern [AB] zugesetzt. Nach Gleichgewichtseinstellung werden gebundene Fraktion [B] und ungebundene Fraktion [F] getrennt und der Quotient ([B]/[F]) gegen [B] in einem Diagramm aufgetragen (Scatchard-Plot). Es ergibt sich gemäß der von Scatchard hergeleiteten Gleichung:

[B]/[F] = K_a[AB] - K_a[B]

eine Gerade mit negativer Steigung, welche K_a darstellt. Der x-Achsenabschnitt gibt die Anzahl der Antigenbindungstellen [AB] wieder, der y-Achsenabschnitt stellt (K * [AB]) dar.
Der Meßbereich sollte mindestens von 20 bis 75 % der Maximalbindung reichen. Für eine einheitliche Bindungsstelle sind 6 bis 10 Meßwerte ausreichend, für zwei Bindungsstellen sind 15 bis 20 Werte erforderlich. Drei verschiedene Bindungsstellen sind maximal erfaßbar, dazu sind mindestens 30 Meßwerte nötig [139].

Scatchard hat u.a. einheitliche Bindungsstellen vorausgesetzt. Dieses ist jedoch nur bei monoklonalen Antikörpern der Fall. Für polyklonale Seren mit Antigenbindungsstellen, die verschieden sind hinsichtlich ihrer Spezifität sowie ihrer Affinität, erhält man aus dem Scatchard-Plot jedoch keine Geradenfunktion. Trägt man die Meßergebnisse von polyklonalen Seren in ein derartiges Diagramm ein, so erhält man eine Kurve, die sich über nichtlineare Regression auswerten läßt. Allerdings sind derartige Messungen mit einem hohen statistischen Fehler behaftet, da die Meßgrößen unterschiedliche Fehlerverteilungen aufweisen, die nicht den Bedingungen der Regressionsmodelle entsprechen. Ein System mit heterogenen Antigenbindungsstellen ist jedoch unter Zuhilfenahme anderer Meßgrößen mathematisch beschreibbar, das Gleichungssystem ist aber nicht lösbar. Durch Reduzierung des Systems auf zwei verschiedene Antigenbindungsstellen kann man ein lösbares System erhalten. Dieses ist aber nur unter der Voraussetzung möglich, wenn Antikörper gegen niedermolekulare Haptene charakterisiert werden sollen und wenn außerdem die zu testenden Substanzen und die radioaktiv markierte Meßsubstanz die gleiche Affinität gegenüber der Antikörperpopulation besitzt [137]. Diese Voraussetzung ist jedoch in dieser Arbeit nicht erfüllt.

Die Spezifität sagt aus, wie genau die Antikörper zwischen dem Antigen bzw. Hapten und chemisch verwandten Verbindungen unterscheiden können. Ein Antikörper mit hoher Spezifität zeigt nur geringe oder keine Affinität zu Antigenen oder Haptenen, die eine ähnliche Struktur besitzen wie das Antigen, gegen das der Antikörper erzeugt wurde. Ist die Affinität zu strukturähnlichen Antigenen hoch, ist die Spezifität des Antiserums gering. Es werden die Affinitäten bzw. die Assoziationskonstanten zweier chemisch ähnlicher Verbindungen verglichen. Man erhält als Größe die relative Kreuzreaktivität.
Man unterscheidet verschiedene Arten der Kreuzreaktivität, die sich daraus ergeben, daß man monovalente und polyvalente Seren differenziert [57]. Monovalente Seren sind spezifisch für ein Epitop, hier handelt es sich meistens um monoklonale Antikörper. Polyvalente Seren sind polyklonale Seren oder Mischungen aus monoklonalen Antikörpern. Diese enthalten Antikörperpopulationen gegen mehrere Epitope eines Antigens.
Die "true crossreactivity" liegt vor, wenn strukturverschiedene Determinanten von Antigenen mit verschiedenen Affinitäten um die einzige Population von Antigenbindungsstellen konkurrieren. Man findet sie also nur bei monovalenten Seren.
Konkurrieren verschiedene Liganden mit gleicher oder unterschiedlicher Affinität um eine von mehreren Antigenbindungsstellen, so spricht man von "shared reactivity". Sie setzt sich aus mehreren echten Kreuzreaktivitäten zusammen. Dieses ist bei polyvalenten Seren der Fall.
Die Kreuzreaktivität von Antiseren kann durch die Konkurrenzreaktion eines markierten Antigens oder Haptens mit steigenden Konzentrationen eines Kompetitors gemessen werden [57].

In der Literatur werden polyklonale Seren meist nur durch die Angabe des Titers sowie der Spezifität charakterisiert. Wird K_a angegeben, wird nur in wenigen Fällen beschrieben, wie der Wert ermittelt wurde.

1.8 Isolierung von Antikörpern

1.8.1 Antikörper aus Kaninchenserum

Um Antikörper für die Immunaffinitätschromatographie verwenden zu können, müssen diese zunächst aus dem Serum isoliert und gereinigt werden. Die Immunglobulinkonzentration in den Serum betrug ungefähr 10 mg/ml, davon waren rund 2 % spezifisch.
Zur Isolierung von Antikörpern werden verschiedene Verfahren angewendet, die man in verschiedene Gruppen trennen kann (Tab. 1-6).

Tab. 1-6: Methoden zur Isolierung von Antikörpern

Methode	Hilfsmittel	gewonnene Fraktion	Bemerkungen	beschrieben zur Gewinnung von:	Literatur
Präzipitationsverfahren		-	-	-	-
-	Ammoniumsulfat bei 40 - 50 % Sättigung (je nach Tierart)	Globuline	-	IgG	[48, 58, 59, 96, 140]
-	Polyethylenglykol	Globuline	-	IgG/IgY	[124, 141]
-	Caprylsäure	Albumine	Abtrennung der Albumine, Globuline bleiben in Lösung	IgG	[59]
-	Dextransulfat	Globuline	-	IgY	[142]
-	Verdünnung mit Wasser, Einfrieren/Auftauen	Globuline	-	IgY	[142]
-	10-fache Verdünnung bei pH 5	Lipoproteine	-	IgY	[116]
Immunpräzipitation	Zugabe der entsprechenden Antigene	spez. IgG	nur bei hochmolekularen Antigenen	IgG	[58]
Alkoholpräzipitation	Isopropanol	Globuline	-	IgY	[143]
Chromatographische Verfahren		-	-	-	-
Affinitäts- chromatographie	Protein A, Protein G	Immunglobuline	-	IgG	[57, 59]
-	Phenylboranat-Agarose	Glycoproteine	-	IgG	[144]
-	Avid AL*	Immunglobuline	Elektronen- Donor-Akzeptor-Wechselwirkungen	IgG/IgY	[145, 146]
-	Histidyl-Aminohexyl- Sepharose	Immunglobuline	beschrieben für monoklonale AK	IgG	[147]
-	Hydroxylapathit	Imunglobuline	-	-	[59]
-	anti-Ig-Säule	Immunglobuline	-	-	[59]
Ionenaustausch- chromatographie	Anionenaustauscher	Globuline	-	IgG	[48, 58, 59, 140]
-	Kationentauscher	Globuline	-	IgY	[148]
hydrophobic interaction chromatography (HIC)	Phenylsepharose	Immunglobuline	Vorfraktionierung mit Polyethylenglykol, anschließend Gelfiltration	IgY	[149]
Gelfiltration	-	Globuline	-	IgG	[48, 58, 59, 140]
Immunaffinitäts- chromatographie	Hapten-/Antigen-Säule	spez. IgG	-	-	[48, 58, 59, 140]

* Chromatographiematerial auf Agarosebasis, hergestellt durch Derivatisierung mit Dichlortrifluorpyridin, Dimethylaminopyridin und Mercaptoethanol

Die in Tabelle 1-6 genannten Verfahren bieten größtenteils nur eine grobe Vorreinigung. Lediglich die Affinitätschromatographie an Protein A und an einer anti-Ig-Säule erlauben eine befriedigende Reinigung in einem Schritt. Bei Verwendung anderer Verfahren wird von Halow und Lane [59] sowie von Steward [58] empfohlen, mehrere Methoden zu kombinieren. Steward [58] schlägt die Ammoniumsulfatfällung als ersten Schritt vor, auf den entweder die Ionenaustauschchromatographie, die Gelfiltration, Elektrophorese oder die Gradientenultrazentrifugation folgen kann. Auch die Verbindung von Ammoniumsulfatfällung und Anionenaustauschchromatographie sowie die fraktionierende Präzipitation mit Caprylsäure und Ammoniumsulfat haben sich als gute Kombinationen erwiesen [59]. Farjam et al. [75] präzipitieren zunächst die nicht-IgG-Proteine mit Caprylsäure, um anschließend die polyklonalen Antikörper mit Ammoniumsulfat (50 % Sättigung) zu fällen.
Zur Isolierung von Kaninchen-IgG haben sich die Kombinationen Ammoniumsulfatfällung/Anionenaustauschchromatographie, Chromatographie an Hydroxylapatit/Ammoniumsulfatfällung [59].

1.8.2 Antikörper aus Eidotter

Die Isolierung und Reinigung von aviären Antikörpern muß anders vorgenommen werden als die Isolierung und Reinigung von Antikörpern aus Serum, da der Dotter zu ca. 30 % aus Lipoproteinen besteht, die mit den für Seren geeigneten Verfahren nicht abgetrennt werden.
Zu diesem Zweck wurden verschiedene Verfahren entwickelt, die sich hinsichtlich des Arbeitsaufwandes, der damit erreichten Ausbeute und Reinheit der Antikörper sowie den möglichen Aktivitätsverlust unterscheiden (Tab. 1-6).
Für die Isolierung von Immunglobulinen mit Hilfe von Kationenaustausch wurde eine Wiederfindungsrate von 34 % bei einer Reinheit von 60 % ermittelt [148].
Die Kombination HIC/Gelfiltration erreicht geringere Ausbeuten als die Fällung mit Polyethylenglykol nach Polson et al. [141] bei vergleichbarer Aktivität und Reinheit [149].
Mittels Dextransulfatfällung wurden 70 - 80 % Wiederfindung, mittels Wasserverdünnung mit Einfrier- und Auftauzyklus nur 50 - 70 % erreicht [142].

Die Verdünnungsmethode [116], die Polyethylenglykol-Fällung [141], die Dextransulfatfällung [142] sowie die Fällung mit Xanthan wurden von Akita und Nakai [150] vergleichend auf ihre Leistungsfähigkeit getestet. Dabei erreichte die Verdünnungsmethode die höchste Wiederfindung und die höchste Reinheit bei der geringsten Anzahl der Arbeitsschritte. Sie stellten außerdem fest, daß Polyethylenglykol besser die Antikörper präzipitiert als Ammoniumsulfat.

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© Mai 1997

Peter de Leuw , , letzte Aktualisierung: 09.12.2010

http://www.pdeleuw.de/diss/immunisierung.html - ausgedruckt am 20.06.2013