Peter de Leuw:
Gewinnung und Einsatz multispezifischer Antikörper als Hilfsmittel zur Probenvorbereitung in der Rückstandsanalytik von Penicillinen
Antibiotika und andere Arzneimittel werden nicht nur in der Humanmedizin, sondern auch für veterinärmedizinische Zwecke eingesetzt. Besonderes Augenmerk ist hier auf die Verwendung von pharmakologisch wirksamen Substanzen in der Nutztierhaltung zu richten. Diese Substanzen können nach einer veterinärmedizinischen Behandlung in den aus diesen Tieren gewonnenen Lebensmitteln (Muskelfleisch, Organe, Eier, Milch) nachgewiesen werden, wobei die Höhe der Rückstände bei sachgemäßer Durchführung und Einhalten der Wartezeiten unterhalb der rechtlich vorgeschriebenen Höchstmengen liegen sollte. Penicilline gehören heute zu den am häufigsten in der Veterinärmedizin eingesetzten Antibiotika [1, 2].
Strategien zur Rückstandsanalytik von Antibiotika in tierischen Lebensmitteln können in zwei Phasen eingeteilt werden [2a]: In der ersten Phase ("Screening") werden aus der Masse der Proben diejenigen herausgefiltert, die Rückstände enthalten. In der zweiten Phase werden die rückstandshaltigen Proben nochmals zur Identifizierung und
Quantifizierung der Rückstände untersucht. Die Aufteilung in zwei Phasen ist deshalb sinnvoll, weil die Idnetifizierung und Quantifizierung von Antibiotikarückständen nur mit aufwendigen und daher entsprechend kostspieligen Verfahren möglich ist, wogegen die Screening-Verfahren relativ schnell und kostengünstig durchzuführen sind.
Als Screening-Verfahren werden meist mikrobiologische Tests durchgeführt. Mit ihnen sind nur qualitative Aussagen möglich. Diese Verfahren beruhen darauf, daß Mikroorganismen durch Antibiotika in ihrem Wachstum gehemmt werden ("Hemmstofftests"), deshalb können sie keine hohe Spezifität bieten [3]. Außerdem sind für einige Wirkstoffe Rezeptortests erhältlich, die gruppenspezifisch sind, d.h. mit ihnen ist die Aussage möglcih, daß eine bestimmte Antibiotikagruppe, z.B. die der beta-Lactame, anwesend ist.
Bei der Verwendung dieser Verfahren ist zu beachten, daß die nachzuweisenden Wirksoffe mit genügend hoher Empfindlichkeit, d.h. mindestens in der Konzentration der gesetzlich vorgegebenen Höchstmenge erkannt werden. Fällt ein Screening-Test negativ aus, so ist davon auszugehen, daß sich in der Probe keinerlei oder nur minimale Mengen von denjenigen Hemmstoffen befinden, für die der Test empfindlich ist. Einige Wirkstoffe werden jedoch von derartigen Methoden garnicht oder nur mit zu hoher Nachweisgrenze erfaßt. Kann man jedoch Hemmstoffe nachweisen, so muß zur Unterscheidung der Einzelsubstanzen sowie zur Quantifizierung ein chemisch-physikalisches Verfahren durchgeführt werden.
Diese Verfahren sind in vielerlei Hinsicht aufwendig: Der Zeitbedarf pro Analyse
ist hoch, entsprechend viel Arbeitskraft wird gebunden. Der aus dem Lebensmittel
gewonnene Rohextrakt muß besonders aufgereinigt werden, dazu sind oft große Mengen organische Lösungsmittel erforderlich. Um reproduzierbare Ergebnisse im Spurenbereich zu erhalten, muß die Arbeitskraft gut eingearbeitet sein.
Als Ergänzung zu den unspezifischen mikrobiologischen Tests und Rezeptortests einerseits und den aufwendigen physikalisch-chemischen Methoden andererseits bieten sich Verfahren an, die zur Probenvorbereitung eine immunologische Reaktion ausnutzen und mit einem physikalisch-chemischen Nachweisverfahren gekoppelt werden können. Die Antigen-Antikörper-Wechselwirkung als hochspezifische Reaktion eignet sich in besonderer Weise zur Isolierung von Analyten aus einer Matrix, so daß die Gewinnung eines sauberen Extraktes zur anschließenden (flüssigkeits-) chromatographischen Analyse mit relativ geringem Aufwand möglich sein sollte. Durch Automatisierung eines solchen Verfahrens ist gerade im Spurenbereich eine hohe Reproduzierbarkeit im Vergleich zu rein manuellen Verfahren mit vielen Einzelschritten zu erwarten. Voraussetzung für die Realisierung eines solchen Verfahrens ist die Gewinnung geeigneter Antikörper, die zur Herstellung einer Immunaffinitätssäule an ein unlösliches Trägermaterial gebunden werden müssen.
Im Rahmen dieser Arbeit sollte ein Verfahren entwickelt werden, das es erlaubt, mit Hilfe von immobilisierten Antikörpern immunaffinitätschromatographisch alle veterinärmedizinisch relevanten Penicilline zu isolieren und diese on-line mit einer HPLC oder off-line mit einem beliebigen physikalisch-chemischen Verfahren zu koppeln.
Penicilline besitzen als Grundstruktur die 6-Aminopenicillansäure (6-APA). Sie kann als bicyclisches Dipeptid aus den Aminosäuren Cystein und Valin aufgefaßt werden, aus denen auch die Biosynthese erfolgt [4]. Man kann die Struktur auch als kondensiertes beta-Lactam- und Thiazolidinringsystem sehen (Abb. 1-1). Die einzelnen Penicilline unterscheiden sich nur durch die Seitenkette an der Aminofunktion an C6.
Von den natürlichen Penicillinen hat nur das Benzylpenicillin Bedeutung erlangt. Es ist sowohl säure- als auch penicillinaseempfindlich und unwirksam gegen die meisten gramnegativen Keime. Um diese Nachteile zu umgehen, wurden semisynthetische Penicilline entwickelt [5]. Durch enzymatische Spaltung wird aus Benzylpenicillin 6-Aminopenicillansäure gewonnen. Nach Acylierung mit geeigneten Carbonsäuren oder Carbonsäurechloriden entstehen neue Penicilline. Auch die Zugabe von geeigneten Vorläufersubstanzen zu Penicillium-Kulturen führt zur Bildung von semisynthetischen Penicilinen.
Abbildung 1-2 zeigt die Strukturen sowie die Namen der veterinärmedizinisch relevanten Penicilline.
Die Carboxylfunktion der Penicilline hat eine Säurekonstante (pKa) von 2,6 - 2,8, die Aminofunktion der Seitenkette der amphoteren Penicilline (Ampicillin, Amoxicillin) hat einen pKa von 7,0 - 7,4.
Die 6-Aminopenicillansäure zeigt keine nennenswerte UV-Absorption, die Absorption der Penicilline wird durch die aromatischen Seitenketten hervorgerufen [6, 7].
Penicilline sind mit Ausnahme von Amoxicillin und Ampicillin als freie Säuren nicht, als Kalium- und Natriumsalze dagegen gut wasserlöslich. Die Salze mit organischen Basen wie Procain und Benzathin sind nur schlecht wasserlöslich. Sie werden als "Depotpenicilline" eingesetzt, die sich durch eine verzögerte Verteilung und Eliminierung im Organismus auszeichnen.
Penicilline sind in kristalliner Form stabil, in Lösung erfolgt dagegen ein rascher Abbau durch Nucleophile und Elektrophile [8].
Das Stabilitätsmaximum in Lösung liegt zwischen pH 6 und 7, bei amphoteren Penicillinen zwischen pH 4 und 5 [6].
Das System aus beta-Lactam und Thiazolidinring ist empfindlicher gegenüber Nucleophilen, Elektrophilen und Oxidationsmitteln als eine einfache beta-Lactamstruktur, da der beta-Lactamring durch die Kondensation mit dem Thiazolidinring aus seiner planaren Struktur gezwungen wird, so daß keine Acylamid-Resonanz mehr möglich ist. Der nucleophile Abbau beginnt mit der Öffnung des beta-Lactamringes an C7 [6] und der Bildung einer tetraedrischen Zwischenstufe. Elektronenziehende Substituenten an C6 beschleunigen den Angriff.
Elektrophile greifen am beta-Lactam-Stickstoff oder am Schwefel des Thiazolidinringes an. Nach der Öffnung des beta-Lactamringes durch Protonen wird der Thiazolidinring geöffnet. Elektronenziehende Substituenten an C6 hemmen den elektrophilen Angriff [6]. 6-APA ist sehr säurestabil [7].
Eine weitere Möglichkeit zur Inaktivierung von Penicillinen besteht in der Öffnung des beta-Lactamringes durch beta-Lactamasen (Penicillinasen). Diese Enzyme können von einigen Bakterien (z.B. Staphylokokken) gebildet werden, die dadurch penicillinresistent werden.
Tabelle 1-1 gibt eine Übersicht über die Stabilität verschiedener Penicilline gegen Penicillinase und Säure [6, 9].
| Penicillin | Säurestabilität | Penicillinase- stabilität | Wirkung gegen Gramnegative | Bemerkungen |
|---|---|---|---|---|
| Penicillin G | - | - | - | natürliches Penicillin |
| Penicillin V | + | - | - | - |
| Amoxicillin | + | - | + | bessere Resorption als Amp |
| Ampicillin | + | - | + | - |
| Oxacillin | + | + | - | - |
| Cloxacillin | + | + | - | - |
| Dicloxacillin | + | + | - | - |
Benzylpenicillin wird zu therapeutischen und prophylaktischen Zwecken eingesetzt. Hauptanwendungsgebiet ist die Behandlung von Mastitis (Euterentzündungen), Harnweginfektionen und Erkrankungen des Gastro-Intestinal-Traktes [2]. Der wirtschaftliche Wert einer prophylaktischen Behandlung ist beträchtlich: Mastitis-Infektionen verursachen einen Verlust von 11 % des finanziellen Gewinns, wobei der Hauptanteil (70 %) durch reduzierte Milchproduktion bedingt ist. Nicht verwertbare Milch nach Medikation, Kosten von Arzneimittel und Arzt und vorzeitige Auslese der infizierten Tiere verursachen weitere finanzielle Verluste, die sich durch eine prophylaktische Behandlung stark eindämmen lassen [10].
Wenn keine Penicillinallergie vorliegt, sind Penicilline bei Infektionen wegen der fehlenden Toxizität bei Tier und Mensch das Mittel der Wahl. Da Isoxazolylpenicilline die Penicillinaseproduktion in Bakterien induzieren können, besteht jedoch Hospitalismusgefahr [5]. Mit gutem Erfolg werden Penicilline gegen Streptokokken-Mastitis eingesetzt. Gegen Staphylokokken-Mastitis sind Penicilline dagegen weniger gut geeignet, da einige Staphylokokken durch Penicillinaseproduktion resistent sind. Benzylpenicillin und Ampicillin finden Verwendung bei der Bekämpfung von Endometritis (Entzündung der Gebärmutterschleimhaut). Infektionen des Verdauungstraktes können gut mit Procain- Benzylpenicillin, Ampicillin oder Amoxicillin beseitigt werden [3, 10].
Durch Kombination eines penicillinaselabilen Breitspektrum-Penicillins (Ampicillin, Amoxicillin) mit einem penicillinasestabilen Penicillin kann eine Addition der Wirkungsbereiche erzielt werden [5]. Bei Kombination mit Aminoglycosid-Antibiotika ist ein Synergismus gegen grampositive Keime zu beobachten [8].
Neben Präparaten mit Einzelwirkstoffen sind auch viele Präparate mit Wirkstoffkombinationen im Handel. Penicilline werden u.a. kombiniert mit Aminoglycosid-Antibiotika, z.B. Dihydrostreptomycin.
In dieser Arbeit soll ein Verfahren entwickelt werden, mit dem verschiedene Penicilline gleichzeitig erfaßt werden können. Daher sind besonders die Präparate interessant, die Kombinationen verschiedener Penicilline enthalten. Häufig ist die Kombination von Ampicillin und Cloxacillin zu finden, aber auch andere Kombinationen von amphoteren und Isoxazolylpenicillinen werden verwendet, z.B. Ampicillin + Dicloxacillin und Ampicillin + Oxacillin [11].
Unter normalen Kochbedingungen werden Penicilline teilweise bis komplett inaktiviert [12, 13], so daß sie keine antimikrobielle Wirkung mehr haben. Es kann nicht ausgeschlossen werden, daß sich auch Penicillin-Protein-Konjugate bilden [12]. Diese können als Immunogene wirken und so allergische Reaktionen hervorrufen. Über den Abbau von Penicillinen durch Räuchern und Pökeln liegen keine Angaben vor. Bei der Herstellung von Rohwurst dürften die geringe Antibiotikarückstände keinen Einfluß haben.
Bei nicht sachgerechter medizinischer Behandlung oder Nichtbeachten der Wartezeiten treten Arzneimittelrückstände in Lebensmitteln auf. In einer kanadischen Studie wird außerdem gezeigt, daß bei der Behandlung von Tieren mit Benzathin-Benzylpenicillin nach 30 bis 50 Tagen Wartezeit an den Einstichstellen Rückstände von mehr als dem 20-fachen des Grenzwertes für die USA und Kanada von 50 µg/kg auftreten. Die Rückstände in Leber, Niere und Muskel lagen dagegen unterhalb des Grenzwertes [14].
Penicillin-Rückstände in Lebensmitteln können sowohl gesundheitliche als auch wirtschaftliche Schäden verursachen.
Die Hauptnebenwirkung von Penicillinen ist die allergische Reaktion [8]. Meist wird sie durch Milch oder Milchprodukte hervorgerufen, es sind jedoch auch allergische Reaktionen nach dem Genuß von penicillinhaltigem Fleisch dokumentiert [15].
Die Möglichkeit der Bildung von resistenten Bakterienstämmen durch Penicillinrückstände sollte nicht vernachlässigt werden [8, 15]. Resistente Stämme erhalten durch die ständige Anwesenheit von Antibiotika einen Selektionsvorteil. Dieses führt dazu, daß zunächst behandelbare Infektionen nicht mehr mit den gewohnten Mitteln zu bekämpfen sind so so zu einer ernsthaften Gefährdung führen.
Der wirtschaftliche Schaden durch Penicillinrückstände tritt besonders bei der Weiterverarbeitung auf [16]. Vor allem die Verarbeitung von Milch wird durch Hemmstoffrückstände unmöglich, da die Starterkulturen für die Herstellung von Yoghurt, Käse und anderen Produkten nicht wachsen können. Der so entstandene wirtschaftliche Schaden betrug in den 60er Jahren in der Bundesrepublik 400 - 500 Mio. DM. Inzwischen wurde die Situation durch konsequente Kontrollen jedoch gebessert [16]. Die Daten der Schlachttier- und Fleischuntersuchung in der Bundesrepublik von 1987 wurden vom Statistischen Bundesamt ausgewertet. Demnach waren 11 % der Rückstandsuntersuchungen positiv. Davon wurden bei Schlachttieren 93,3 % als Antibiotika identifiziert, bei Fleischteilen enthielten 60,8 % der rückstandspositiven Proben Antibiotika [17]. Eine kanadische Studie zeigt, daß 1989 in mehr als der Hälfte der untersuchten Lebensmittelproben tierischer Herkunft Hemmstoffe nachgewiesen werden konnten. Davon wiederum die Hälfte wurden als Penicilline identifiziert [18].
Nach einer Medikation von Nutztieren können Rückstände von Tierarzneimitteln in Lebensmitteln auftreten. Bei Nichteinhalten von Dosierungsangaben und Wartezeiten können diese oft in gesundheitlcih bedenklicher Höhe oder oberhalb der gesetzlich festgesetzten Höchstmenge nachgewiesen werden. Außerdem sind Rückstände möglich durch die illegale Verwendung von Arzneimitteln zu Mastzwecken.
In Deutschland ist der Einsatz von Antibiotika bei Tieren, die der Lebensmittelgewinnung dienen, im Lebensmittel- und Bedarfsgegenstände-Gesetz (LMBG) [19] in den Paragraphen 8 (Verbote zum Schutz der Gesundheit) und 15(2) (Stoffe mit pharmakologischer Wirkung), sowie in der darauf basierenden Verordnung über Stoffe mit pharmakologischer Wirkung [25] geregelt. Weitere Bestimmungen finden sich in der Fleischhygiene-Verordnung [21] (§ 5(2) und Anlage 1, Kapitel II: Schlachttier- und Fleischuntersuchung), der Milchverordnung [22] (§ 5(3) und Anlage 6: Anforderungen an die Behandlung der Milch im Be- und Verarbeitungsbetrieb) sowie der Milch-Güteverordnung [23]. Die Milchverordnung fordert nach der Hitzebehandlung keine nachweisbaren Antibiotika in der Milch. Die Milch-Güteverordnung schreibt in § 2(3) monatlich 2 Untersuchungen der Anlieferungsmilch auf Hemmstoffe nach der Anlage sowie 2 Untersuchungen nach § 35 LMBG vor. Verwendet wird als Testkeim Bacillus stearothermophilus var. calidolactis sowie Penicillinase zur Festellung von Penicillinen.
Die nationalen Regelungen in Europa werden zunehmend durch Verordnungen und Gesetze der EG abgelöst. Die EG-Verordnung (EG-VO) 675/92 [24], setzt für den europaweiten Verkehr mit Lebensmitteln konkrete Grenzwerte für Penicillinrückstände in Lebensmitteln fest (Tabelle 1-2):
| Wirkstoff | Muskulatur, Leber, Niere, Fett (µg/kg) | Milch (µg/kg) |
|---|---|---|
| Benzylpenicillin | 50 | 4 |
| Ampicillin | 50 | 4 |
| Amoxicillin | 50 | 4 |
| Oxacillin | 300 | 30 |
| Cloxacillin | 300 | 30 |
| Dicloxacillin | 300 | 30 |
Die Dissertation wurde am 28. Juni 1996 vom Fachbereich Naturwissenschaften II (Chemie/Biologie) der Bergischen Universität-Gesamthochschule Wuppertal angenommen.
, , letzte Aktualisierung: 20.10.2003
http://www.pdeleuw.de/diss/einl.html - ausgedruckt am 07.09.2010
