Peter de Leuw:
Gewinnung und Einsatz multispezifischer Antikörper als Hilfsmittel zur Probenvorbereitung in der Rückstandsanalytik von Penicillinen
Da im Laufe dieser Arbeit keine Affinitätssäule mit genügend hoher Bindungskapazität hergestellt werden konnte, wurde auf eine Immunaffinitätssäule zurückgegriffen, die uns freundlicherweise von Herrn Prof. Dr. E. Märtlbauer und Herrn Dr. E. Usleber vom Lehrstuhl für Hygiene und Technologie der Milch, Universität München zur Verfügung gestellt wurde.
Die dort verwendeten Antikörper sind durch Immunisierung von Kaninchen mit einem Cloxacillin-Humanserumalbumin-Konjugat entwickelt worden. Die Antikörper wurden an cyanbromidaktivierte Sepharose gebunden und zeigten folgende Kreuzreaktivitäten (Cloxacillin = 100 %) [53]:
| Oxacillin: | 4 % |
| Dicloxacillin: | 62 % |
Märtlbauer und Usleber schlagen folgende Vorschrift für die Immunaffinitätschromatographie vor:
Für eine Säule mit einem Bettvolumen von 250 - 400 µl sollte die Elution mit 2,5 ml Elutionspuffer erfolgen.
Eigene Untersuchungen zeigten, daß 2,5 ml zur vollständigen Elution nicht ausreichen, es sind mindestens 5 ml erforderlich. Später stellte sich heraus, daß die Elution mit diesem Puffer nicht quantitativ ist: Mit dem testweise eingesezten Elutionspuffer aus Glycinpuffer, pH 3,0 + Acetonitril (9 + 1, v/v) ließen sich größere Mengen der Analyten eluieren, auch wenn vorher kein Penicillin mehr aufgegeben wurde. In den folgenden Untersuchungen wurde daher dieser Puffer zur Elution verwendet. Auf die Regeneration wurde verzichtet.
Zur Ermittlung der Säulenkapazität wurden 1 µg Cloxacillin (1 µg/ml PBS) auf die Säule aufgegben und mit 5 ml PBS nachgewaschen. Die Aufgabe- und Waschpuffer sowie die Elutionsfraktionen wurden getrennt gesammelt, nach Extraktion mit Dichlormethan und Aufkonzentrieren wurde mit Brommethylmethoxycumarin derivatisiert und per HPLC analysiert.
In den einzelnen Fraktionen wurden folgende Mengen an Cloxacillin nachgewiesen:
| nichtgebundene Fraktion + Waschfraktion I: | 281 ng |
| Waschfraktion II: | - |
| Elutionsfraktion I: | 446 ng |
| Elutionsfraktion II: | 423 ng |
| Elutionsfraktion III: | - |
| Summe: | 1150 ng |
Die Säule konnte bei einem Bettvolumen von ca. 250 µl rund 870 ng Cloxacillin binden.
Im Laufe dieser Arbeit wurde die IgG-Affinitätssäule ungefähr 300 Analysenläufen unterzogen, davon ungefähr die Hälfte mit Extrakten aus Muskelfleisch, Leber und Milch und die andere Hälfte mit Standardlösungen. Der Betrieb der Säule erfolgte bei Raumtemperatur mit ungekühlten Puffern. Nach ca. 200 Zyklen ließ die Bindungsfähigkeit langsam nach, sie war jedoch nach 250 - 280 Zyklen noch uneingeschränkt brauchbar. Erkennbar war dieses durch eine langsame Verringerung der erhaltenen Peakflächen, die eine häufige Kontrolle mit externem Standard notwendig machte. Im Laufe der letzten Zyklen wurde die Bindungsfähigkeit so weit reduziert, daß die Säule unbrauchbar wurde.
Die Immunaffinitätschromatographie (IAC) sollte unter dem Aspekt der Automatisierbarkeit und der besseren Reproduzierbarkeit in die HPLC eingebunden werden. Die Apparatur mußte daher folgende Elemente enthalten:
Zur automatischen Festphasenextraktion stand der On-line Sample Preparator (OSP-2)
der Firma Merck zur Verfügung. Dabei erfolgt die Anreicherung an einer Vorsäule mit den Maßen 4 mm x 4 mm i.D., die mit LiChrosorb C-18, 5 µm gefüllt war. Nach der Anreicherung wird die Säule automatisch mechanisch in den HPLC-Kreislauf gebracht.
Bei der Verknüpfung der Immunaffinitätschromatographie mit der Hochdruckflüssigchromatographie mußte beachtet werden, daß die Immunaffinitätssäule aufgrund des Agarose-Trägermaterials nicht druckstabil ist. Bei der Anreicherung am OSP-2 wird aber ein Rückdruck von ca. 14 bar bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min aufgebaut. Das Eluat der Affinitätssäule mußte daher zunächst von einer Probenschleife aufgenommen werden, bevor die darin enthaltenen Penicilline an der automatischen Festphasenextraktion angereichert werden konnten.
Die Detektion erfolgte bei Milch- und Muskeluntersuchungen durch einen UV-Detektor
bei 230 nm. Bei der Analyse von Penicillinen aus Leber wurde zwischen analytische
Säule und Detektor ein Photoreaktor geschaltet. Darin wurde das Eluat mit 254 nm bestrahlt. Die Isoxazolylpenicilline entwickeln unter diesen Bedingungen ein Nebenmaximum bei 300 nm, das zur Detektion herangezogen wurde [46, 189]. Die Versuchsanordnung mit eingebautem Photoreaktor kann auch zur Analyse von Milch- und Muskelproben beibehalten werden, wenn die UV-Lampe des Photoreaktors nicht eingeschaltet wird. Die Analysenzeiten verlängern sich dann lediglich um 2,5 Minuten pro Lauf.
Die Steuerung der gesamten Anlage wurde vom Controller L-5000 übernommen, dessen Programmierung im Anhang I.5 dargestellt ist.
Die Puffer- und Probenextraktlösungen wurden ausschließlich mit einem Dilutor auf die Immunaffinitätssäule gegeben. Dessen Programmierung ist im Anhang I.4 abgedruckt.
Das Dotieren der Matrices erfolgte so, daß die Integrität der Probe durch den Dotiervorgang möglichst wenig beeinträchtigt wurde. Die Analyten wurden daher in Wasser (physiologisches Lösungsmittel, Hauptbestandteil der Proben) gelöst. Die maximale Zugabemenge betrug 2 % der Probeneinwaage. Durch Einarbeiten der Analyten in die Matrix sollte annähernd ein gewachsener Rückstand simuliert werden. Ergänzend dazu wurde vor der Extraktion eine Standzeit von 10 - 15 min bei Raumtemperatur eingehalten.
Bei dieser Bestimmung wurde sowohl die Immunaffinitätschromatographie, die Anreicherung als auch die anschließende HPLC mit Detektion bei 230 nm berücksichtigt. Die Extraktion der Analyten aus der Lebensmittelmatrix sollte hier nicht betrachtet werden. In den folgenden Untersuchungen wurde Cloxacillin als wichtigster Vertreter der Isoxazolylpenicilline ausführlich untersucht, Oxacillin und Dicloxacillin wurden lediglich modellhaft betrachtet. Zur abschließenden Beurteilung der erhaltenen quantitativen Daten sind daher noch weitere Untersuchungen erforderlich. Die Reproduzierbarkeit wurde mit Cloxacillin ermittelt, indem von einer Standardlösung, die einer Probenkonzentration von 300 µg/kg entsprach (37,5 ng/10 ml Extrakt), neun Aliquots (je 10 ml) auf die Immunaffinitätssäule gegeben wurden. Folgende Werte wurden ermittelt (Tab. 5-1).
| Anzahl der Analysen | 9 |
| Mittelwert | 22449 µVs |
| Standardabweichung | 683 µVs |
| Variationskoeffizient | 3,0 % |
| Wiederfindung | 68 % |
Die Milch wurde durch Zentrifugation bei 4 °C entfettet und mittels Ultrafiltration deproteiniert. Als Ausschlußvolumen erwiesen sich 30 kDa als ausreichend. Die Abtrennung von Penicillinen aus Milch durch Ultrafiltration wurde bereits von Tyczkowska et al. [190] beschrieben. Die Arbeitsgruppe verwendete ein Ausschlußvolumen von 10 kDa und stellten Verluste von bis zu 50 % bei Benzylpenicillin fest. Zur Verbesserung der Ausbeute setzen Tyczkowska et al. ein Gemisch von Acetonitril, Methanol und Wasser zu. Diese Maßnahme verursachte in eigenen Untersuchungen Störungen im Chromatogramm. Es zeigte sich auch, daß eine Erhöhung der Extraktionsausbeute nicht notwendig war, da sie für alle drei Isoxazolylpenicilline befriedigend war (Tab. 5-2). Die Nachweisgrenze wurde auf Basis des dreifachen Grundrauschens abgeschätzt.
| Wiederfindung | Nachweisgrenze | |
|---|---|---|
| Oxacillin | 90 % | 3 µg/kg |
| Cloxacillin | 83 % | 2 µg/kg |
| Dicloxacillin | 62 % | 9 µg/kg |
Die vorhergehende Entfettung verbessert die Analysenresultate nicht, sie wurde aber
trotzdem durchgeführt, um die Ultrafiltrationsmembran, die mehrfach verwendet wurde, nicht unnötig zu belasten und die Reinigung zu erleichtern. Bei Verwendung von Einmal-Filtrationseinheiten kann auf die Entfettung ohne weiteres verzichtet werden.
Bei der Grenzwertkonzentration von 30 µg/kg Cloxacillin wurden bei einer Wiederholungsbestimmung von 6 Milchproben folgende Daten erhalten (Tab. 5-3).
| Anzahl der Analysen | 6 |
| Mittelwert | 19627 µVs |
| Standardabweichung | 1763 µVs |
| Variationskoeffizient | 9,0 % |
| Extraktionsausbeute | 83 % |
Die Abbildungen 5-1 (a) - (d) zeigen die erhaltenen Chromatogramme aus Milch nach
Ultrafiltration mit einem Ausschlußvolumen von 30 kDa. Vor der Ultrafiltration wurde die Milch durch Zentrifugation entfettet. 1 ml des klaren Filtrates wurden auf 10 ml verdünnt und auf die Affinitätssäule aufgegeben. Das entpricht einer Absolutmenge von 30 ng Penicillin. Die Detektion erfolgte im UV bei 230 nm. Das Signal bei 16,5 min in allen Chromatogrammen stammt aus dem Acetonitril des Elutionspuffers, mit dem die SPE-Kartusche konditioniert wurde. Es läßt sich durch die Verwendung von Acetonitril höherer Reinheit eliminieren.
Die Penicillinkonzentrationen lagen bei je 30 µg/kg, das entspricht dem zur Zeit gültigen EG-Grenzwert.
Da die Immunaffinitätschromatographie ein sehr spezifisches Reinigungsverfahren darstellt, erschien eine Vorreinigung der entfetteten Milch durch Abtrennung der Proteine zunächst unnötig. Erste Experimente, in denen entfettete Milch direkt auf die Immunaffinitätssäule gegeben wurde, zeigten aber, daß das resultierende Chromatogramm so starke Störungen zeigte, daß eine Erfassung der Penicilline nicht möglich war. Auch die Photoderivatisierung mit anschließender Fluoreszenzdetektion (Anregung bei 300 nm, Emission bei 400 nm) [46, 189] brachte keine Abhilfe.
Die Fällung der Proteine mit Acetonitril (10 ml Milch + 10 ml Acetonitril) ergab kein besseres Ergebnis.
Bei der Extraktion von Rindermuskel wurde zunächst eine rein wäßrige Extraktion getestet, da der Extrakt zur Aufgabe auf die Affinitätschromatographie keine hohen Anteile an organischen Lösungsmitteln enthalten durfte. Ausgangspunkt für die Untersuchungen waren die Arbeiten von Agasøster [191] und Aerts [192], die die Reinigung der Probenextrakte mittels Dialyse vornahmen und deshalb kein organisches Lösungsmittel einsetzen durften, sondern zur Extraktion physiologische Kochsalzlösung verwendeten. Auf die Homogenisierung mit einem Dispergiergerät (Ultra Turrax) wurde in eigenen Arbeiten allerdings verzichtet, um eine zu starke Zerkleinerung des Fleisches zu vermeiden. Die feinen Gewebsfragmente könnten möglicherweise durch Zentrifugation nicht abgetrennt werden und führten anschließend zu einer Verstopfung der Affinitätssäule. Die Extraktion wurde daher sicherheitshalber ausschließlich im Ultraschallbad vorgenommen. Die Tabelle 5-4 zeigt die verwendeten Extraktionslösungen und die damit erzielten Extraktionsausbeuten für Cloxacillin. Es wurden jeweils 5 g Muskelfleisch in einem Universalzerkleinerer zerkleinert und nach der im Kapitel 8.16 abgedruckten Vorschrift mit 300 µg/kg Cloxacillin dotiert. Die Zugabe von 2 ml Hexan erleichterte die Abtrennung der Fettphase.
| Extraktionslösung | Menge | Chromatogramm | Ausbeute |
|---|---|---|---|
| Natriumchloridlösung (0,9 g/100 ml) | 10 ml | störungsfrei | 25 % |
| Natriumchloridlösung (0,9 g/100ml) | 2 x 5 ml | störungsfrei | 35 % |
| Phosphatpuffer, pH 2,2, 0,5 mol/l | 10 ml | störungsfrei | 45 % |
| Acetonitril | 2 x 5 ml | störungsfrei | 50 % |
| Natriumchloridlösung/Acetonitril (1 + 1) | 2 x 5 ml | störungsfrei | 81 % |
| Phosphatpuffer, pH 2,2/Acetonitril (1 + 1) | 2 x 5 ml | *) | 83 % |
*) es bildeten sich zwei flüssige Phasen, die beide Cloxacillin enthielten. Die untere zeigte Störungen,
die obere war störungsfrei
Für die weiteren Untersuchungen wurden jeweils 5 g Muskelfleisch mit 2 x 5 ml Natriumchloridlösung/Acetonitril (1 + 1, v/v) extrahiert.
Die erzielten Wiederfindungsraten sowie die abgeschätzten Nachweisgrenzen (dreifaches Grundrauschen) sind in Tabelle 5-5 wiedergegeben.
| Wiederfindung | Nachweisgrenze | |
|---|---|---|
| Oxacillin | 54 % | 40 µg/kg |
| Cloxacillin | 89 % | 30 µg/kg |
| Dicloxacillin | 66 % | 80 µg/kg |
Bei der Wiederholungsmessung von mehreren Muskelfleischproben mit je 300 µg/kg Cloxacillin ergaben sich folgende Daten für die Reproduzierbarkeit (Tabelle 5-6).
| Anzahl der Analysen | 6 |
| Mittelwert | 23402 µVs |
| Standardabweichung | 342,4 µVs |
| Variationskoeffizient | 1,5 % |
| Extraktionsausbeute | 89 % |
Die Abbildungen 5-2 (a) - (d) zeigen die Chromatogramme zur Bestimmung der Isoxazolylpenicilline aus Rindermuskel bei einer Konzentration von 300 g/kg. Auch hier stammt das in allen Chromatogrammen auftauchende Signal bei 16,5 min aus dem zur Konditionierung der SPE-Kartusche verwendeten Acetonitril. Bei Verwendung von Acetonitril, das mit anderen Verfahren als der Destillation über Kaliumcarbonat gereinigt wurde, tritt dieses Signal nicht mehr auf.
Für die Extraktion von Leber wurden die Bedingungen der Muskelfleischextraktion übernommen. Allerdings erwies sich die Detektion im UV bei 230 nm als unbrauchbar (Abb. 5-3).
Daher wurde eine photochemische Nachsäulenderivatisierung nach [46, 189] mit Detektion bei 300 nm eingesetzt. Dadurch wird die Detektion zwar um den Faktor 2 - 4 unempfindlicher, jedoch ermöglicht die erhöhte Selektivität der Detektion eine ungestörte Detektion der Analyten. Der Empfindlichkeitsverlust der Detektion konnte durch Verdoppelung der Rohextraktmenge, die zur Immunaffinitätschromatographie eingesetzt wurde (500 µl statt 250 µl), sowie durch Verringerung der Integratorabschwächung um eine Stufe ausgeglichen werden. Die erzielten Wiederfindungsraten und die auf der Basis des dreifachen Grundrauschens abgeschätzten Nachweisgrenzen sind in Tabelle 5-7 aufgelistet. Die Reproduzierbarkeit wurde aus acht Wiederholungsanalysen ermittelt (Tab. 5-8).
| Wiederfindung | Nachweisgrenze | |
|---|---|---|
| Oxacillin | 60 % | 150 µg/kg |
| Cloxacillin | 65 % | 140 µ/kg |
| Dicloxacillin | 60 % | 225 µg/kg |
| Anzahl der Analysen | 8 |
| Mittelwert | 3510 µVs |
| Standardabweichung | 226,6 µVs |
| Variationskoeffizient | 6,5 % |
| Extraktionsausbeute | 65 % |
In den Abbildungen 5-4 (a) - (d) sind die Chromatogramme zur Bestimmung der Penicilline aus Rinderleber bei 300 µg/kg wiedergegeben.
Die Dissertation wurde am 28. Juni 1996 vom Fachbereich Naturwissenschaften II (Chemie/Biologie) der Bergischen Universität-Gesamthochschule Wuppertal angenommen.
, , letzte Aktualisierung: 20.10.2003
http://www.pdeleuw.de/diss/einbindung.html - ausgedruckt am 07.09.2010
