Peter de Leuw:
Gewinnung und Einsatz multispezifischer Antikörper als Hilfsmittel zur Probenvorbereitung in der Rückstandsanalytik von Penicillinen
Zwischen dem Logarithmus der Laufstrecke eines Proteins in der SDS-PAGE und dessen Molekulargewicht besteht ein linearer Zusammenhang. Unter den in Kapitel 8.6 vorgegebenen Bedingungen ergab sich bei einem Gel mit 7,5 % Polyacrylamid folgende Gerade:
Die zugehörige Geradengleichung lautet:
log (Laufstrecke [cm]) = -3,61 * 10-3 * Molekulargewicht [kDa]+ 0,854
Die Quantifizierung von 6-Aminopenicillansäure wurde nach Derivatisierung mit 1,2,4-Triazol zur Bestimmung der Kopplungsrate bei der Herstellung des Haptensorbens durchgeführt. Die Bestimmung wurde wie in Kapitel 8.12 beschrieben durchgeführt.
Die folgende Eichgerade wurde erhalten:
Die zugehörige Regressionsgleichung lautet:
E325nm = 0,067 * c(6-APA) [mg/10 ml] - 0,015
Folgende Lösungen wurden verwendet:
| A: | Acetonitril | |
| B: | Tridest. Wasser | |
| C: | Elutionspuffer: | Acetonitril/0,02 mol/l Phosphatpuffer pH 3,0 (1 + 9) |
| D: | HPLC-Eluent: | Acetonitril/0,2 mol/l Phosphatpuffer pH 3,0 (35 + 65) |
| I: | Aufgabepuffer IAC: | 0,02 mol/l Phosphatpuffer pH 7,2; 0,15 mol/l NaCl |
| II: | Elutionspuffer IAC: | Lösung C |
| III: | Lebensmittelextrakt oder Standard |
Die Schlauchverbindungen vom Niederdruckschaltventil zum Dilutor, vom Probengefäß zum Schaltventil und vom Dilutor zur Affinitätssäule wurden mit einem möglichst geringen Innendurchmesser gewählt, um Totvolumina gering zu halten. Die maximale Geschwindigkeit, mit der die Pufferlösungen vom Dilutor angesaugt werden können, ohne ein Vakuum zu erzeugen, ist vom Innendurchmesser der Zuleitungen begrenzt. Bei der Erstellung des Programms wurde die unter den gegebenen Bedingungen maximal mögliche Geschwindigkeit gewählt.
Die Ausstoßgeschwindigkeit und damit die Aufgabegeschwindigkeit auf die Affinitätssäule entspricht 1 ml/min (5 ml in 3000/10 Sekunden = 300 Sekunden = 5 Minuten).
Der Dilutor gibt in Schritt 6. ein Mindestvolumen für die Spritze von 5 ml an. Da
aber nur eine 10 ml-Spritze zur Verfügung stand, wurde diese verwendet.
Das Ansaugvolumen wurde unter Berücksichtigung des kleinsten benötigten Volumens auf 5 ml festgelegt. Da das Probenvolumen in 10 ml aufgetragen wird, muß die Probenaufgabe in zwei Schritte aufgeteilt werden. Es ist prinzipiell möglich, für jeden Schritt der Immunaffinitätschromatographie, d.h. zum Equilibrieren, Probenaufgabe, Waschen, Eluieren und Equilibrieren je ein Programm einzugeben und die Programme anschließend in einem Verbindungsprogramm zu verknüpfen. Damit könnte die Probe in einem Schritt aufgegeben werden. Auf diese Möglichkeit wurde aber verzichtet, da so eine Automatisierung nicht mehr möglich ist: Der Dilutor verlangt nach jedem Programmdurchlauf ein erneutes Starten, wobei auch die Enter-Taste betätigt werden muß. Diese läßt sich aber nicht extern ansteuern und musste von Hand bedient werden.
Die Tabelle zeigt die im Dilutor-Programm eingegebenen Parameter:
| Schritt Nr. | Parameter | Eingabe | Erläuterung |
|---|---|---|---|
| 1. | FILE NUMBER | 1 | Wahl der Programm-Nummer |
| 2. | SELECT MODE | DIS | Dispense-Modus |
| 3. | DELIVERY | 5000 | Ansaugvolumen: 5000 µl |
| 4. | NB ALIQUOTS | 1 | Das Volumen wird in einem Aliquot ausgegeben |
| 5. | MAN. 0-AUTO.1 | 0 | manueller Start nach jedem Dosiervorgang |
| 6. | SYRNG (5 ML) | 10000 | Spritzenvolumen: 10000µl (10 ml) |
| 7. | ASPIR. TIME | 1000 | Ansaugzeit [in 1/10 s] |
| 8. | DELIV. TIME | 3000 | Ausgabezeit [in 1/10 s] |
| 9. | PRIME TIME | 500 | Spülzeit [in 1/10 s] |
Der Controller L-5000 steuert die Gradientenpumpe zum Betrieb des OSP-2 und besitzt
zusätzlich acht Schaltausgänge. Die ersten fünf Ausgänge werden zur Steuerung des OSP-2 benötigt (Schaltung der Ventile, Drehen des Ringes). Die restlichen drei Ausgänge können zur Kontrolle der anderen Peripheriegeräte verwendet werden. Ausgang 6 wird zur Umschaltung des Schaltventils ELV-7000 (mit 5 ml-Probenschleife zur Aufgabe des IAC-Eluates auf die Anreicherungskartusche) benutzt, Ausgang 7 schaltet das Niederdruckschaltventil LMV 870 (Wahl des Puffers für die IAC), Ausgang 8 startet den Dilutor.
Günstig wäre ein neunter Schaltausgang zum Start des Integrators. Hier führte aber auch die Parallelschaltung mit Ausgang 2 zum Ziel. Dieser Ausgang bedient das 6-Wege-Ventil im HPLC-Kreislauf des OSP-2. Mit der Einbindung der Anreicherungskartusche in den HPLC-Kreislauf (Ventil 2 schaltet in Position 2) startet die Analyse. Der entsprechende Schaltimpuls ist nur einmal im Analysenverlauf nötig.
Die Grundstellung der Gerätekonfiguration vor Beginn der ersten Analyse ist:
| OSP-2: | - Anreicherungskartusche in Ringposition 1, Ringposition 1 und 2 in der Klammer - Klammer auf, beide Ventile in Position 1 (Grundstellung nach dem Einschalten des Gerätes) - In Ringposition 2 und 72 muß ebenfalls eine Kartusche eingesetzt werden, um zu gewährleisten, daß die Klammer nicht schräg sitzt und dicht abschließt. Diese Kartuschen werden nicht zur Anayse selbst benötigt. |
| LMV 870: | Position 1 |
| ELV 7000: | Position load |
| Dilutor: | Programm 1 einstellen und mit "enter" bestätigen, Spritzenvolumen bestätigen |
Der Analysenablauf wird durch Starten des Controllers begonnen.
Das Controller-Programm zeigt die Tabelle:
| Zeit | % B | % C | Fluß | Event 1 | Event 2 | Erläuterung der Events | Erläuterung des Programms |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 0 | 50 | 0 | 1 | 82 | 31 | Dilutor Start Klammer zu | 0 - 17 min Waschen der SPE-Kartusche 0 - 6,7 min Equilibrieren der IAC |
| 0,1 | - | - | - | 11 | - | Ventil 1 Pos. 2 | - |
| 6,7 | - | - | - | 72 | - | LMV 870 Pos. 2 | - |
| 6,8 | - | - | - | 72 | 82 | LMV 870 Pos. 3 Dilutor Start | 6,8 - 13,5 min Probenaufgabe IAC Teil 1 |
| 13,6 | - | - | - | 82 | - | Dilutor Start | 13,6 - 20,3 min Probenaufgabe IAC Teil 2 |
| 16,9 | 50 | 0 | - | 72 | - | LMV 870 Pos. 4 | - |
| 17 | 0 | 100 | 1 | 72 | - | LMV 870 Pos. 5 | 17 - 34 min Equilibrieren der SPE-Kartusche |
| 17,1 | - | - | - | 72 | - | LMV 870 Pos. 6 | - |
| 20,4 | - | - | - | 72 | 82 | LMV 870 Pos. 1 Dilutor Start | 20,4 - 27,1 min Waschen der IAC |
| 27,2 | - | - | - | 72 | 82 | LMV 870 Pos. 2 Dilutor Start | 27,2 - 33,9 min Elution der IAC |
| 30,7 | - | - | - | 72 | - | LMV 870 Pos. 3 | - |
| 30,8 | - | - | - | 72 | - | LMV 870 Pos. 4 | - |
| 30,9 | - | - | - | 72 | - | LMV 870 Pos. 5 | - |
| 31 | - | - | - | 72 | - | LMV 870 Pos. 6 | - |
| 31,1 | - | - | - | 72 | - | LMV 870 Pos. 1 | - |
| 34 | - | - | - | 62 | 82 | ELV 7000 inject Dilutor Start | 34 - 39 min Aufgabe des Eluates auf die SPE 34 - 40,7 min Equilibrieren der IAC |
| 39 | 0 | 100 | 1 | 10 | 30 | Ventil 1 Pos.1 Klammer auf | 39 - 39,2 min Umsetzen der SPE-Kartusche |
| 39,1 | 0 | 100 | 0,5 | - | 42 | Ringdrehung | - |
| 39,2 | - | - | - | 31 | 21 | Klammer zu Ventil 2 Pos. 2 | 39,2 - 41,2 min Elution der SPE-Kartusche |
| 41,2 | 0 | 100 | 0,5 | 20 | 30 | Ventil 2 Pos. 1 Klammer auf | 41,2 - 41,4 min Zurücksetzen der SPE-Kartusche |
| 41,3 | 50 | 0 | 2 | 51 | 42 | Richtung Ringdrehung | - |
| 41,4 | - | - | - | 31 | 11 | Klammer zu Ventil 1 Pos. 2 | 41,4 - 49,4 min Regenerieren der SPE-Kartusche |
| 41,5 | - | - | - | 50 | 62 | Richtung ELV 7000 load | - |
| 44,4 | 50 | 0 | 2 | - | - | - | - |
| 44,5 | 0 | 0 | 2 | - | - | - | - |
| 49,4 | 0 | 0 | 2 | 10 | - | Ventil 1 Pos. 1 | - |
| Nr. | Kapitel | Titel |
|---|---|---|
| 1-1 | 1.2.1.1 | 6-Aminopenicillansäure und ihre Strukturelemente |
| 1-2 | Strukturen, Namen und Abkürzungen der veterinärmedizinisch relevanten Penicilline | |
| 1-3 | 1.4.4.1 | Prinzip der Immunaffinitätschromatographie zur Reinigung von Rohextrakten |
| 1-4 | 1.4.4.2 | Modell eines Immunglobulin G (IgG) bzw. -Y (IgY) |
| 1-5 | 1.4.4.5 | Aktivierung von Agarose mit Cyanbromid und Immobilisierung von Proteinen |
| 1-6 | Immobilisierung von Proteinen an einer mit Azlacton aktivierten Matrix | |
| 1-7 | Ungerichtete (a) und gerichtete (b) Immobilisierung von Antikörpern | |
| 1-8 | 1.4.4.6 | Immobilisierung von Proteinen an einer durch Oxidation eines Kohlenhydratrestes entstandenen Aldehydgruppe |
| 1-9 | 1.5.2 | Mögliche Reaktionen von Nitrenen |
| 1-10 | Reaktion von Singulett-Arylnitrenen über ein elektrophiles Intermediat | |
| 2-1 | 2.1 | Syntheseweg des Immunogens |
| 2-2 | 2.2 | Infrarotspektrum von p-Azidobenzoesäure |
| 2-3 | 2.3 | Infrarotspektrum von p-Azidobenzoylchlorid |
| 2-4 | 2.4 | Infrarotspektrum von 4-Azidobenzoylpenicillin |
| 2-5 | 2.5 | 1H-NMR-Spektrum von 4-Azidobenzoylpenicillin |
| 4-1 | 4.2.1.1 | Röntgenfilm des Immunblots von Kaninchenserum und -IgG |
| 4-2 | 4.2.1.2.1 | Titer der Seren vom 119. Tag |
| 4-3 | Titer der Seren vom 276. Tag | |
| 4-4 | 4.2.1.2.2 | Spezifität des anti-6-APA-KLH-Serums vom 119. Tag |
| 4-5 | 4.3.1.1.1 | Ermittlung des anti-6-APA-OVA-Antikörpertiters in den Eidottern vom 84. Tag |
| 4-6 | Titerentwicklung in den Eidottern | |
| 4-7 | 4.3.1.1.2 | Entwicklung der Antikörperspezifität bei Tier 15: Tag 29 (a), Tag 169 (b) und Tag 196 (c) |
| 4-8 | Entwicklung der Kreuzreaktivität von Benzylpenicillin und Ampicillin bei Tier 15 | |
| 4-9 | 4.3.2.2.1 | Immobilisierung von 6-Aminopenicillansäure |
| 4-10 | 4.3.2.2.2 | Affinitätsreinigung von Immunglobulin Y an einer Haptensäule |
| 4-11 | 4.3.2.3 | Gelelektropherogramm der Globulinfraktion von Eidotter |
| 4-12 | Anstieg des Antikörpertiters bei der Isolierung von anti-6-APA-Antikörpern | |
| 4-13 | Vergleich der spezifischen Fraktionen I und II | |
| 5-1 | 5.3.3 | Nachweis von Penicillinrückständen in Milch |
| 5-2 | 5.3.4 | Nachweis von Penicillinrückständen in Rindermuskel |
| 5-3 | 5.3.5 | Leber, Blindprobe mit UV-Detektion, 230 nm |
| 5-4 | Nachweis von Penicillinrückständen in Rinderleber | |
| 6-1 | 6.8 | Vergleich des Zeitaufwandes der GC-Methode und der automatisierten Methode |
| 6-2 | Vergleich des Lösungsmittelverbrauchs der automatisierten Methode mit immunaffinitätschromatographischer Extraktreinigung und der GC-Methode | |
| 6-3 | 6.9 | Entfettete Milch, Blindprobe ohne Ultrafiltration; Detektion: UV 230 nm |
| Nr. | Kapitel | Titel |
|---|---|---|
| 1-1 | 1.2.1.3 | Stabilität von Penicillinen gegenüber Penicillinase und Säure |
| 1-2 | 1.3 | Höchstwerte für Penicilline in Lebensmitteln nach der EG-VO 675/92 |
| 1-3 | 1.4.4.5 | Übersicht über die ungerichtete Immobilisierung von Antikörpern in der Literatur |
| 1-4 | 1.4.4.6 | Übersicht über die gerichtete Immobilisierung von Antikörpern in der Literatur |
| 1-5 | 1.5.3.2 | Unterschiede zwischen Immunglobulin G und Immunglobulin Y |
| 2-1 | 2.8 | Übersicht über die Parameter bei der photochemischen Kopplung |
| 4-1 | 4.2.1.2.2 | Kreuzreaktivitäten des Serums nach der Immunisierung mit den 6-APA-Immunogenen |
| 4-2 | 4.3.1.1.1 | Antikörpertiter in den Eidottern und Blutseren vom 84. Tag |
| 4-3 | 4.3.1.1.2 | Veränderung der Spezifität der Dotterantikörper |
| 4-4 | 4.3.1.1.2 | Reproduzierbarkeit des ELISA |
| 4-5 | 4.3.2.3 | Vergleich der Antikörperspezifität vor und nach der Isolierung |
| 4-6 | 4.3.3.1 | Durch Immobilisierung von IgY erhaltene Affinitätsmaterialien |
| 5-1 | 5.3.2 | Reproduzierbarkeit der Chromatographie |
| 5-2 | 5.3.3 | Wiederfindung und abgeschätzte Nachweisgrenze der Isoxazolylpenicilline aus Milch (30 µg/ml) |
| 5-3 | Reproduzierbarkeit der Cloxacillinbestimmung aus Milch (30 g/kg) | |
| 5-4 | 5.3.4 | Extraktion von Rindermuskel, dotiert mit 300 µg/kg Cloxacillin |
| 5-5 | Wiederfindung und abgeschätzte Nachweisgrenze der Isoxazolylpenicilline aus Rindermuskel (300 µg/ml) | |
| 5-6 | Reproduzierbarkeit der Cloxacillinbestimmung aus Rindermuskel (300 µg/kg) | |
| 5-7 | 5.3.5 | Wiederfindung und abgeschätzte Nachweisgrenze der Isoxazolylpenicilline aus Rinderleber (300 µg/ml) |
| 5-8 | Reproduzierbarkeit der Cloxacillinbestimmung aus Rinderleber (300 µg/kg) |
| 6-APA | 6-Aminopenicillansäure |
| Abb. | Abbildung |
| AK | Antikörper |
| Amox | Amoxicillin |
| Amp | Ampicillin |
| BR-Test | Brillantschwarz-Reduktionstest |
| BrMMC | 4-Brommethyl-7-methoxycumarin |
| BSA | bovines Serumalbumin |
| CDI | Carbodiimid, Carbonyldiimidazol |
| Cex | Cephalexin |
| Clox | Cloxacillin |
| CV | Variationskoeffizient ( = s/Mittelwert) |
| d.h. | das heißt |
| DC | Dünnschichtchromatographie, Dünnschichtchromatogramm |
| Diclox | Dicloxacillin |
| DMF | Dimethylformamid |
| DMSO-d6 | Dimethylsulfoxid, 6-fach deuteriert |
| EG | Europäische Gemeinschaft |
| EIA | Enzymimmunoassay |
| ELISA | enzyme-linked immuno sorbent assay |
| et al. | et alii (und andere) |
| FCA | komplettes Freundsches Adjuvans |
| FIA | inkomplettes Freundsches Adjuvans |
| HPLC | high-performance liquid chromatography (Hochleistungs-Flüssigchromatographie) |
| I.E. | internationale Einheiten |
| i.m. | intramuskulär |
| i.v. | intravenös |
| IAC | Immunaffinitätschromatographie |
| IgG | Immunglobulin G |
| IgY | Immunglobulin Y |
| IR | Infrarotspektroskopie, Infrarotspektrum |
| kDa | Kilo-Dalton (1000 Dalton) |
| KG | Körpergewicht |
| KLH | keyhole limpet hemocyanin |
| LMBG | Lebensmittel- und Bedarfsgegenstände-Gesetz |
| M | Mega- |
| Mio. | Millionen |
| mmol | millimol (1/1000 mol) |
| n | Anzahl der Analysen |
| Naf | Nafcillin |
| ng | Nanogramm |
| NHS | N-Hydroxysuccinimid |
| OVA | Ovalbumin |
| Oxa | Oxacillin |
| PBS | phosphatgepufferte Salzlösung |
| Pen G | Benzylpenicillin, Penicillin G |
| Pen V | Phenoxymethylpenicillin, Penicillin V |
| pH | negativer dekadischer Logarithmus des Betrages der Wasserstoffionen-Konzentration |
| pKa | Säurekonstante |
| PNPP | p-Nitrophenylphosphat |
| RIA | Radioimmunoassay |
| s | Standardabweichung |
| s.u. | siehe unten |
| Sdp. | Siedepunkt |
| SPE | Festphasenextraktion, solid phase extraction |
| Tab. | Tabelle |
| TBST | Tris-gepufferte Salzlösung, tweenhaltig |
| u.a. | unter anderem |
| UV | Ultraviolett |
| VO | Verordnung |
| z.T. | zum Teil |
| µVs | Flächeneinheit in Chromatogrammen (Mikrovolt x Sekunde) |
Die Erstellung dieser Arbeit erfolgte auf einem Apple Macintosh LC II 10/540 mit folgender Software:
| Textverarbeitung und Satz | Aldus PageMaker Classic |
| Erstellung der Tabellen | ClarisWorks Version 2.1/4.0 |
| Tabellenkalkulation zur Auswertung von RIA und ELISA | ClarisWorks Version 2.1 |
| Grafik | ClarisWorks Version 2.1/4.0 CSC ChemDraw Version 3.1 CA-Cricket Graph III Version 1.01 Logitech ScanMan Version 2.2 NIH Image Version 1.52 |
| Umsetzung in das HTML-Format | ClarisWorks Version 4.0 SimpleText Version D1-1.2 Grafikkonverter Version 2.8(D) |
Die Dissertation wurde am 28. Juni 1996 vom Fachbereich Naturwissenschaften II (Chemie/Biologie) der Bergischen Universität-Gesamthochschule Wuppertal angenommen.
, , letzte Aktualisierung: 20.10.2003
http://www.pdeleuw.de/diss/anhang.html - ausgedruckt am 07.09.2010
