Peter de Leuw:
Gewinnung und Einsatz multispezifischer Antikörper als Hilfsmittel zur Probenvorbereitung in der Rückstandsanalytik von Penicillinen
Zur Rückstandsanalytik von Penicillinrückständen stehen verschiedene Verfahren zur Verfügung. Lange Zeit wurde die Analytik durch mikrobiologische Hemmstofftests geprägt, die aufgrund ihrer Mechanismen nicht in der Lage sind, zwischen verschiedenen Substanzen zu unterscheiden. Rezeptortests weisen oft eine Stoffgruppenspezifität auf, eine Aussage über Einzelsubstanzen ermöglichen sie aber ebensowenig wie die Hemmstofftests. Quantitative Aussagen sind mit allen derartigen Tests nicht oder nur begrenzt möglich.
Demgegenüber erlauben es chromatographische Methoden, Einzelsubstanzen zu unterscheiden und zu quantifizieren. In der Regel ist aber für jede Substanzklasse ein eigenes Verfahren nötig.
Da mikrobiologische Tests nur unvollständige Informationen bieten und andererseits chromatographische Methoden sehr aufwendig sind, bietet sich die Kombination von mehreren Verfahren an. Mit mikrobiologischen Tests kann zunächst auf Rückstandsfreiheit geprüft werden. Bei rückstandspositiven Befunden kann durch ein spezifischeres Verfahren die Substanzklasse bestimmt werden. Im Anschluß daran folgt ein chromatographisches Verfahren zur genauen Identifizierung und Quantifizierung. So kann die Probenanzahl, die mit einem chromatographischen Verfahren untersucht werden muß, drastisch gesenkt werden.
Einen Überblick über die verschiedenen Methoden bietet die Literatur [2a,15, 25, 26].
Bei den in der Literatur häufig als "Screening-Verfahren" bezeichneten Testverfahren handelt es sich um schnelle, einfache und kostengünstige Verfahren zur Detektion von Hemmstoffen, wobei die erzielte Nachweisgrenze stark von Wirkstoff abhängt. Die meisten Screening-Verfahren beruhen auf mikrobiologischen Prinzipien. Die eingesetzten Mikroorganismen (z.B. Bacillus stearothermophilus var. calidolactis, Bacillus subtilis) werden durch Antibiotikarückstände in der Probe im Wachstum gehemmt. Es ist in der Regel nicht möglich, anhand dieser Verfahren quantitative Aussagen zu machen oder den Wirkstoff zu bestimmen. Ein positives Ergebnis aus einem Screening-Verfahren muß daher durch ein chemisch-physikalisches Verfahren bestätigt und quantifiziert werden.
Außerdem werden immunologische und enzymatische Verfahren eingesetzt. Einige enzyme linked immunosorbent assays (ELISA) erlauben auch quantitative Aussagen.
Es sind verschiedene leistungsfähige Testsysteme für Lebensmittel im Handel, die teilweise für bestimmte Hemmstoffe oder Hemmstoffgruppen optimiert sind:
Der in die Amtliche Methodensammlung nach § 35 LMBG aufgenommene 3-Platten-Test verwendet als Testkeim Bacillus subtilis. Die drei Kulturplatten unterscheiden sich in ihrem pH-Wert. Der 3-Platten-Test wird auch als "Allgemeiner Hemmstofftest" bezeichnet. Im 4-Platten-Test wird zusätzlich eine Kulturplatte mit dem Keim Micrococcus luteus zur besseren Erfassung der Aminoglycosid-Antibiotika eingesetzt [27]. Auf die Platten wird die zu untersuchende Probe oder ein Probenextrakt gegeben. Die in der Probe enthaltenen Hemmstoffe diffundieren in die Agarschicht der Kulturplatten und hemmen die dort eingeimpften Keime im Wachstum.
Ebenfalls auf dem Prinzip der Agar-Diffusion beruhen der Delvo-Test [28] und der Brillantschwarz-Reduktionstest (BR-Test) [29]. Als Testkeim fungiert in beiden Fällen Bacillus stearothermophilus var. calidolactis. Die im Testsystem enthaltenen Indikatoren (im BR-Test Brillantschwarz als Redoxindikator, im Delvo-Test ein pH-Indikator) reagieren auf die Anwesenheit von Stoffwechselprodukten des Testkeimes. Im Delvo-Test wurden falsch-positive Befunde durch Lactoferrin und Lysozym nachgewiesen [30]. Hier wird die Notwendigkeit der Bestätigung durch ein physikalisch-chemisches Verfahren deutlich. Der BR-Test wird von der Milchindustrie im großen Maßstab zur Prüfung der Anlieferungsmilch eingesetzt. Außerdem wurde er in die Methodensammlung nach § 35 LMBG aufgenommen.
Mit demselben Testorganismus arbeitet der Blättchentest, der ebenfalls in dieser Methodensammlung enthalten ist. Bei diesem Test erlaubt das Ausmessen von Hemmhöfen eine quantitative Aussage über die Hemmstoffmenge. Er soll verwendet werden, um im BR-Test positive oder zweifelhafte Proben zu bestätigen.
Ein Referenzverfahren zur Bestimmung von Antibiotika und Sulfonamiden" ist sowohl im Amtsblatt der Europäischen Gemeinschaften [31] als auch in der Methodensammlung nach § 35 LMBG beschrieben. Das Verfahren erlaubt im ersten Schritt die Selektion von antibiotika- und sulfonamidhaltigen Proben, im zweiten Schritt kann eine Quantifizierung der Hemmstoffe vorgenommen werden. Es wird wiederum Bacillus stearothermophilus var. calidolactis als Testorganismus verwendet. Die Quantifizierung findet in einem ergänzenden Schritt wie beim Blättchentest durch Bestimmung der Hemmzonengröße statt.
Als Rezeptor-Test werden die Systeme CITE-Probe-Test und Charm-Test [32] bezeichnet. Durch den Einsatz von hemmstoffgruppenspezifischen Rezeptoren im Testsystem (z.B. Penicillin bindende Proteine) sind diese gruppenspezifisch.
Eines der wichtigsten immunologischen Verfahren ist der ELISA. Er ermöglicht in einigen Fällen quantitative Aussagen und kann, je nach verwendeten Antikörpern, eine Spezifität für eine bestimmte Substanz aufweisen. Dieses ist besonders vorteilhaft, wenn für eine Wirkstoffgruppe nicht ein Summengrenzwert festgelegt ist (z.B. für Tetracycline und Sulfonamide), sondern, wie bei den Penicillinen, die Höchstmengen für die Einzelwirkstoffe unterschiedlich sind [1].
Alle Schnelltests liefern einen relativ hohen Anteil an falschpositiven Proben. Er kann bis zu 80 % beim Delvo-Test, 44 % beim CITE-Probe-Test und 19 % beim Blättchentest betragen [33].
Für den Nachweis von beta-Lactam-Antibiotika kann die Zuhilfenahme von Penicillinase sinnvoll sein: Ist eine Probe hemmstoffpositiv und nach der Behandlung mit Penicillinase hemmstoffnegativ, so handelt es sich bei dem Hemmstoff um ein beta-Lactam-Antibiotikum. In eigenen Versuchen wurde festgestellt, daß durch die in solchen Fällen eingesetzten hohen Penicillinasekonzentrationen auch die als penicillinasefest bezeichneten Isoxazolylpencilline zerstört werden. Allerdings berichten Moats et al. [34], daß auch andere Hemmstoffe durch Penicillinase inaktiviert werden können. Der Einsatz von Penicillinase ist auch bei allen Verfahren der Methodensammlung nach § 35 LMBG vorgesehen.
Der Vorteil der Schnelltests liegt also darin, schnell und kostengünstig rückstandshaltige von rückstandsfreien Proben zu trennen, um die rückstandshaltigen anschließend mit einem aufwendigen chemisch- physikalischen Verfahren zu untersuchen. Durch die Verifizierung der hemmstoffpositiven Befunde können so falschpositive Testergebnisse erkannt werden.
Wie bereits zuvor erwähnt wurde, ist die Probenvorbereitung der zeit- und materialaufwendigste Arbeitsschritt der chromatographischen Verfahren. Sie beginnt mit der Homogenisierung des Lebensmittels. Darauf folgt die Extraktion und Deproteinierung. Diese wird durch Zugabe von Acetonitril [15, 25], Methanol [15, 25], Schwefelsäure/Natriumwolframat [30, 31], Dichlormethan [25, 37] oder Ultrafiltration [15, 25] bewirkt. Durch diesen Schritt werden an Proteine adsorbierte Wirkstoffe freigesetzt und der Analyse zugänglich gemacht sowie Emulsionsbildung vermieden [36].
Der so gewonnene Rohextrakt muß, bevor er chromatographisch analysiert werden kann, weiter gereinigt und konzentriert werden. Dazu werden in der Regel flüssig-flüssig-Verteilungen zwischen organischen Lösungsmitteln und wäßrigen Puffern unterschiedlichen pH-Wertes angewendet [25]. Außerdem sind Reinigungsschritte an Festphasen [25] sowie die HPLC-Fraktionierung [38] üblich. Die Festphasenextraktion kann an Ionenaustausch- [39], Diol- [39], basischem Aluminiumoxid [15] oder Umkehrphasenmaterial [35] stattfinden. Für die Isoxazolylpencilline wurde eine automatisierte Festphasenextraktion an RP-18-Material beschrieben [40].
Die chemisch-physikalischen Methoden umfassen dünnschichtchromatographische, gaschromatographische und flüssigchromatographische Verfahren.
1977 wurde die erste chromatographische Bestimmungsmethode für Penicillinrückstände veröffentlicht [12]. Sie beinhaltete die dünnschichtchromatographische Trennung von Benzylpenicillin und dessen Abbauprodukten in erhitztem Fleisch.
Zum Nachweis von sieben monobasischen Penicillinen in vom Tier stammenden Lebensmitteln wurde ein gaschromatographisches Verfahren entwickelt, das die mit Diazomethan methylierten Penicilline mit einem stickstoffselektiven oder massenselektiven Detektor erfaßt [39, 41]. Dieses Verfahren wurde inzwischen zur Aufnahme in die Methodensammlung nach 35 LMBG validiert. Es kann in vereinfachter Form auch zur Bestimmung von Penicillinen in Milch verwendet werden [42].
Die HPLC ist das in der Penicillinanalytik bevorzugte Verfahren. Es wird vorzugsweise mit Umkehrphasen gearbeitet. Einige Arbeitsgruppen verwenden auch RP-18-Material in Verbindung mit Ionenpaarreagenzien (z.B. [37]).
Penicilline können aufgrund ihrer UV-Absorption im Bereich von 210 - 230 nm detektiert werden. Dieser Wellenlängenbereich ist jedoch in der Regel durch Matrixsignale stark gestört, so daß an die Extraktreinigung höchste Ansprüche gestellt werden müssen. Außerdem ist die Detektionsempfindlichkeit nicht sehr hoch. Für quantitative Analysen sind mindestens 20 ng absolut erforderlich.
Eine Alternative stellt die Derivatisierung der Penicilline dar, die die Detektionswellenlänge in längerwellige, weniger störanfällige Bereiche verschiebt oder ein fluoreszierendes Derivat erzeugt [25]. Für Penicilline bieten sich verschiedene Derivatisierungsreaktionen an: Durch Derivatisierung mit 1,2,4-Triazol und Quecksilberchlorid entsteht ein Quecksilbermercaptid, das bei 325 nm detektiert werden kann [35].
Die Derivatisierung mit Brommethylmethoxycumarin ermöglicht die Fluoreszenzderivatisierung von Penicillinen bei einer Anregungswellenlänge von 320 nm und einer Detektionswellenlänge von 400 nm [43]. Ein anderes Verfahren zur Fluoreszenzderivatisierung verwendet Citronensäure und Formaldehyd. Die Detektion erfolgt bei 422 nm, die Anregung bei 346 nm [44]. Die Bestrahlung mit UV-Licht als Nachsäulenderivatisierung ermöglicht die elektrochemische Detektion [45], außerdem wird bei den Isoxazolylpenicillinen eine Verschiebung des Absorptionsmaximum nach 310 nm sowie eine Fluoreszenzaktivität induziert [46].
Die spektroskopische Bestätigung kann in der Flüssigchromatographie durch einen Diodenarraydetektor [46] oder durch Massenspektrometrie [47] erfolgen.
Die Immunaffinitätschromatographie (IAC) beruht auf der spezifischen und reversiblen Wechselwirkung zwischen Antikörper und Antigen. Zur Durchführung der Immunaffinitätschromatographie müssen die gegen den Zielanalyten gerichteten Antikörper an eine unlösliche Matrix immobilisiert und in eine Säule überführt werden [48]. Dabei ist es wichtig, daß zwischen Träger und Antikörper eine feste kovalente Bindung besteht, die die spezifische Bindungscharakteristik des Liganden nicht beeinflußt [49, 50]. Ist die Bindung nicht stabil, kommt es bei mehrfacher Verwendung von Immunaffinitäts-Chromatographiesäulen zum stetigen Verlust von Immunglobulinen und damit zur Verringerung der Säulenkapazität. Es wird häufig beobachtet, daß die Säulenkapazität während des ersten Gebrauchs sinkt, danach aber stabil bleibt [51].
Der Ablauf einer immunaffinitätschromatographischen Reinigung einer Substanz erfolgt in mehreren Schritten (Abb. 1-3):
Die Waschschritte sowie die Elution sollten immer rückwärts erfolgen, um stark bindende und damit schwer eluierbare Probenanteile nicht auf der Säule zu sammeln [52], was allerdings in automatisierten Verfahren nicht immer möglich ist.
In vielen Fällen, so auch in dieser Arbeit, ist es erforderlich, nicht nur eine Substanz nachzuweisen, sondern möglichst alle Mitglieder einer Substanzfamilie. Wenn die nachzuweisenden Substanzen eine dem Immunsystem zugängliche gemeinsame Grundstruktur besitzen, kann man Antikörper erzeugen, die die Grundstruktur dieser Familie erkennen. Man verwendet dazu ein Immunogen, in dem das allen Analyten identische Epitop an einen Träger gekoppelt ist. Zu beachten ist dabei, daß die Antikörper eine genügend hohe Affinität für alle Analyten besitzt. Die Assoziationskonstante sollte zwischen 103 und 108 mol/l liegen [50]. Über gruppenspezifische Antikörper berichten Märtlbauer et al. [53]. Manchmal gelingt es, durch geschickte Wahl der Elutionsbedingungen die Analyten getrennt zu eluieren. Oftmals ist es jedoch sinnvoll, die Immunaffinitätschromatographie zur Isolierung und Anreicherung der Analyten zu nutzen, die Identifizierung und Quantifizierung jedoch mit Hilfe eines physikalisch-chemischen Verfahrens vorzunehmen [54].
Andere Verfahren erlauben auch die Herstellung von Antiseren, die Antikörper gegen chemisch völlig verschiedenartige Analyten enthalten [55]:
Durch die Applikation von verschiedenen Immunogenen gleichzeitig produziert das Immunsystem des Versuchstieres entsprechend unterschiedliche Antikörper. Dieses ist auch zu erreichen, indem man verschiedene Haptene an ein Trägerprotein koppelt. Das Immunsystem erkennt die Haptene als verschiedene Epitope des Protein-Hapten-Konjugates.
Ist es nicht möglich, Antiseren zu gewinnen, mit denen alle Analyten erfaßt werden können, können auch Antikörper aus verschiedenen Seren auf einer Säule immobilisiert werden [56].
Antikörper dienen als Bestandteil des Immunsystems zur Erkennung körperfremder Substanzen. Sie binden an diese, um sie dadurch zu markieren und zu größeren Einheiten zu vernetzen. Die so markierten Substanzen werden von anderen Zellen des Immunsystems, den Phagozyten, erkannt und vernichtet.
Antikörper werden vom Immunsystem als Immunantwort auf die Gegenwart eines Fremdkörpers (Antigens) gebildet. Als Antigen versteht man Substanzen, an die Antikörper binden können. Ein Immunogen ist dagegen eine Substanz, die eine Immunantwort, d.h. die Bildung von Antikörpern auslösen kann. Ein Hapten ist eine Substanz, an die Antikörper binden können, das jedoch keine Immunantwort auslöst. Ein Hapten ist daher ein Antigen, nicht jedoch ein Immunogen [57].
Immunogene müssen für den Wirtsorganismus als körperfremd erkannt werden, um den Abwehrmechanismus auszulösen. Die Immunogenität wird nicht durch das Molekül als Ganzes, sondern nur von Teilbereichen, den sog. Epitopen oder antigenen Determinanten hervorgerufen. Diese Bereiche werden von den Antikörpern erkannt. Ein Immunogen kann mehrere Epitope enthalten, die mit verschiedenen Antikörpern reagieren.
Die phylogenetische Verwandtschaft des Immunogens zum Wirtsorganismus hat entscheidenden Einfluß auf dessen Wirkung. Eine nahe Verwandtschaft hat eine geringe, aber spezifische Immunantwort zur Folge [57].
Antikörper befinden sich in der gamma-Globulinfraktion des Blutserums von Säugern und Vögeln. Sie werden daher Immunglobuline genannt [58]. Alle Immunglobuline (Ig) haben die gleiche Grundstruktur, bestehend aus 4 Polypeptidketten, die durch Disulfidbrücken kovalent verbunden sind. Für die Antigen-Antikörper-Reaktion ist die Tertiärstruktur und damit die Primärstruktur des Antikörpers entscheidend.
Es gibt zwei Arten von Ketten, sogenannte schwere und leichte. Beide besitzen bezüglich ihrer Primärstruktur sowohl konstante als auch variable Regionen. Jedes Immunglobulinmolekül ist symmetrisch aufgebaut und besteht aus zwei identischen schweren und zwei identischen leichten Ketten (Abb. 1-4). Schwere Ketten besitzen 3 konstante (cH1 - cH3) und eine variable (vH) Region, leichte Ketten besitzen je eine konstante (cL) und eine variable (vL) Domäne. Die variablen Domänen bilden die Antigenbindungsstellen. Die vier Ketten bilden eine Y- bzw. T-artige Struktur.
Die Immunglobuline werden in Klassen eingeteilt. Bei Human-Immunglobulinen z.B. kennt man die 5 Klassen IgG, IgM, IgA, IgD und IgE. Sie unterscheiden sich durch die konstanten Regionen der schweren Kette sowie durch ihr Vorkommen als Mono- oder Polymere. So kommt IgA sowohl als Mono- als auch als Dimer vor, während IgM grundsätzlich als Pentamer vorliegt. Die unterschiedlichen Ketten werden entsprechend mit den griechischen Buchstaben gamma, , alpha, delta und epsilon bezeichnet. Bei der gamma-Kette sind 4, bei der alpha-Kette 2 Variationen bekannt: gamma1 - gamma4 sowie alpha1 und alpha2. Sie bestimmen die Unterklasse (Isotyp) der Immunglobuline (IgG1 - IgG4; IgA1, IgA2). Beim Kaninchen dagegen sind keine IgG-Unterklassen bekannt [57].
Jede Ig-Klasse hat ihren charakteristischen Kohlenhydratgehalt, IgG z.B. enthält 3 % Kohlenhydrate. Polymere Immunglobuline besitzen eine zusätzliche J-Kette. IgA wird teilweise in Körperflüssigkeiten, z.B. Speichel sekretiert. Für den Vorgang der Sekretion benötigt es eine Sekretionskomponente (SC) [57]. Bei den leichten Ketten sind kappa- und lamda-Ketten bekannt. Im Folgenden wird nur noch das wichtigste Immunglobulin, das IgG behandelt. Das im Laufe dieser Arbeit ebenfalls verwendete IgY aus Eidottern wird in Kapitel 1.5.3.2 beschrieben.
Im Humanserum findet man 1000 mg IgG/100 ml Serum [57], Harlow und Lane [59] geben 800 - 1600 mg/100 ml an. Sie machen 80 % der Globulinfraktion aus [57].
Die schwere Kette des IgG hat ein Molekulargewicht von 50.000 Da [57] bis 55.000 Da [62], die leichte Kette von 25.000 Da. Ein Immunglobulinmolekül hat damit eine molare Masse von 150 - 160.000 Da.
Behandelt man Immunglobuline unter geeigneten Bedingungen mit Papain, so erhält man 2 antigenbindende Fragmente (Fab; Fragment, antigenbindend) und ein Fragment, das nicht an der Antigenbindung beteiligt ist. Dieses Fragment konnte in kristalliner Form dargestellt werden und wird daher als Fc (Fragment, kristallisierbar) bezeichnet. Es ist für verschiedene Funktionen, u.a. den placentalen Transfer von IgG verantwortlich [57]. Die flexible, enzymsensitive Region wird Scharnier-Region (hinge region) genannt.
Bei Behandlung mit Pepsin entsteht ein bivalentes antigenbindendes Fragment und ein nicht antigenbindendes Fragment, das etwas kleiner ist als jenes, das bei Papainbehandlung entsteht. Diese Fragmente werden als F (ab')2 und Fc' bezeichnet. Das F(ab')2-Fragment kann durch Cystein in 2 Fab' gespalten werden, ohne die antigenbindenden Fragmente zu beschädigen [57, 59, 60].
Ein idealer Träger für die Immunaffinitätschromatographie sollte eine poröse Struktur und damit eine große Oberfläche haben, leicht zu derivatisieren sein, eine hydrophile, aber ungeladene und inerte Oberfläche besitzen, keine unspezifische Adsorption zeigen sowie mechanisch, mikrobiologisch und chemisch stabil sein. Die Poren müssen so groß sein, daß sowohl Antikörper als auch Antigen in sie eindringen können [48, 50, 61, 62]. Diese Anforderungen sind gleichzeitig nicht optimal zu erfüllen, so daß ein geeigneter Kompromiß gefunden werden muß.
Als Träger werden verschiedene Materialien verwendet. Dazu gehören:
Zur Immobilisierung von Antikörpern sind mehrere Verfahren möglich und üblich. Wichtig ist bei allen Methoden, daß der für das jeweilige Immobilisierungsverfahren optimale Puffer und pH-Wert verwendet wird. Dabei ist auch zu berücksichtigen, daß die Reaktionsbedingungen nicht die Antikörper schädigen. Von der Kopplungsmethode hängt auch die Stabilität der resultierenden Bindung ab. Die ideale Kopplungs- und Aktivierungsreaktion erfüllt die folgenden Bedingungen [50]:
Der Aktivierungsgrad des Trägers spielt in diesem Zusammenhang ebenfalls eine große Rolle. Ist die Anzahl der aktiven Gruppen an der Matrix zu hoch (dieses ist bei den meisten kommerziell erhältlichen Materialien der Fall [64]), werden zu viele Antikörper gebunden. Die Antigenbindungsstellen sind so durch die räumliche Nähe untereinander sterisch gehindert [51, 65, 66].
Außerdem werden die Antikörper an mehreren Stellen gleichzeitig gebunden ("multi-site attachment" oder "multi-point attachment"), so daß die Quartärstruktur verzerrt wird und die Aktivität der Antikörper sinkt [62, 64].
Die spezifische Aktivität der immobilisierten Antikörper sinkt also bei Erhöhung der Antikörperdichte und bei Erhöhung der Trägeraktivierung [50, 61, 62]. Dieses gilt allerdings nicht, wenn die Antikörperdichte unterhalb von 1 mg/ml Gel liegt [63, 65]. In diesem Fall ist die sterische Hinderung der Antigenbindungsstellen untereinander bedeutungslos.
Die Bindung der Antikörper an mehreren Stellen kann durch Verringerung der aktiven Gruppen des Trägers und durch die richtige Wahl von pH-Wert und Reaktionszeit verhindert werden [65].
Ein wesentlicher Parameter zur Beurteilung der Antikörperdichte ist nicht die durchschnittliche Antikörperdichte, sondern die lokale Antikörperdichte. Findet die Kopplungsreaktion zu schnell im Verhältnis zur Diffusionsgeschwindigkeit der Antikörper in das Gel statt, so ist die Antikörperdichte an den Außenseiten der Gelpartikel hoch, während im Innern nur wenige Antikörper immobilisiert werden.
Die lokale Antikörperdichte ist so stellenweise hoch, die durchschnittliche Dichte jedoch niedriger. Die Bindungskapazität des Gels liegt aber aufgrund der sterischen Hinderung an den Orten hoher Antikörperdichten niedriger, als aufgrund der durchschnittlichen Antikörperdichte zu erwarten wäre [66].
Als aktive Gruppen des Antikörpers dienen Amino-, Sulfhydryl- oder Hydroxyfunktionen. Meistens werden die Antikörper über Aminofunktionen an einen Cyanbromid-, N-Hydroxysuccinimid (NHS)-, Carbonyldiimidazol (CDI)-, Toluolsulfonylchlorid- (Tresyl-) oder Oxiran-aktivierten Träger gebunden [62]. Die aktive Gruppe sollte in jedem Fall über einen Spacer an den Träger gebunden werden, um den daran zu koppelnden Antikörper auf Abstand zum Träger zu halten. Dadurch werden sterische Effekte vermindert [65]. Folgende Aktivierungsmechanismen werden eingesetzt:
Diese Kopplungsmethoden haben zur Folge, daß die Antikörper in unterschiedlicher Orientierung zum Träger gebunden werden [62] ("statistische" oder "ungerichtete Kopplung") und die meisten Antikörper ihre Fähigkeit zur Bindung des Antigens verlieren (Abb. 1-7 a). Ursache dafür kann sein [51, 62, 64, 65, 69]:
Durch die genannten Effekte können nur 1 - 30 % der theoretischen Antikörperaktivität nach der statistischen Kopplung genutzt werden [62, 64].
Tabelle 1-3 gibt eine Übersicht über die in der Literatur beschriebenen Anwendung der ungerichteten Immobilisierung von Antikörpern.
| Aktivierung | Matrix | Analyt | Antikörper | Quelle |
|---|---|---|---|---|
| CNBr | Agarose | Lysozym | Fragmente | [70] |
| - | - | Lysozym | Fragmente | [71] |
| - | - | Lysozym | monoklonal | [51] |
| - | - | Cytokinine | polyklonal | [72] |
| - | - | humane Plasmaproteine | monoklonal | [65] |
| - | - | Diethylstilbestrol | polyklonal | [73] |
| - | - | Aflatoxin M1 | polyklonal | [74] |
| - | - | Östrogene | polyklonal | [75] |
| Tresyl | Agarose | Clenbuterol | polyklonal | [76] |
| - | - | 19-Nortestosteron | polyklonal | [77] |
| - | - | 19-Nortestosteron | monoklonal | [78] |
| - | - | 19-Nortestosteron | polyklonal | [78] |
| - | - | Virusproteine | monoklonal | [97] |
| - | - | Penicillin G | polyklonal | [79] |
| Tresyl | Silica | Lysozym | Fragmente | [80] |
| - | - | Lysozym | monoklonal | [80] |
| Tresyl | synthetisches Polymer | Prostaglandin F2a | polyklonal | [81] |
| NHS | Agarose | Cytokinine | polyklonal | [72, 82] |
| - | - | Virusproteine | monoklonal | [67] |
| CDI | Agarose | - | - | [82] |
| - | - | Lysozym | monoklonal | [51] |
| - | - | Cytokinine | polyklonal | [72] |
| CDI | Silica | - | - | [83] |
| CDI | synthetisches Polymer | Lysozym | monoklonal | [51] |
| - | - | Chloramphenicol | monoklonal | [68] |
| - | - | Penicillin G | polyklonal | [79] |
| Oxiran | Agarose | - | - | [82] |
| Oxiran | Silica | - | - | [83] |
| - | - | Albumin | polyklonal | [56] |
| - | - | Transferrin | polyklonal | [52, 56] |
| Oxiran | synthetisches Polymer | Carboxypeptidase A | monoklonal | [63] |
| - | - | Meerrettichperoxidase | monoklonal | [52, 63] |
| - | - | Penicillin G | polyklonal | [83] |
| Aldehyd | Agarose | Cytokinine | polyklonal | [72] |
| - | - | Humanserumalbumin | polyklonal | [84] |
| Aldehyd | Silica | Cytokinine | polyklonal | [72, 85] |
| - | - | Cortisol | polyklonal | [86] |
Um die Nachteile der genannten Kopplungsmethoden zu umgehen, besteht die Möglichkeit, eine gerichtete Immobilisierung durchzuführen. Dabei werden die Antikörper mit ihrem Fc-Teil, der nicht an der Antigenbindung beteiligt ist, an den Träger gebunden (Abb. 1-7 b). Bei polyklonalen Antikörpern kann so die dreifache Kapazität gegenüber der statistischen Immobilisierung erreicht werden [64].
Auch für die gerichtete Kopplung gibt es verschiedene Methoden:
Ein Hydrazid-aktivierter Träger ist gegenüber einem mit Aminogruppen aktivierten Träger zu bevorzugen, da bei der Kopplung an ein primäres Amin eine unstabile Schiffsche Base entsteht, die zur Stabilisierung reduziert werden muß. Die Reduktion kann zum Aktivitätsverlust der Antikörper führen. Außerdem kommt es zu Konkurrenzreaktionen zwischen den Aminofunktionen der Matrix und denen der Antikörper selbst, so daß mit inter- und intramolekularer Vernetzung der Antikörper gerechnet werden muß. Auch dieses führt zum Aktivitätsverlust.
Immobilisiert man die oxidierten Antikörper an einen Hydrazid-aktivierten Träger, so kann man den pH-Wert des Kopplungspuffers senken, da der pK-Wert des Hydrazids bei 3 liegt (prim. Amin: 9 - 10). Um die Hydrazidgruppe in der reaktiven unprotonierten Form vorliegen zu haben, reicht daher ein pH-Wert von 4,5 - 5,5. Die primären Aminofunktionen sind unter diesen Bedingungen noch protoniert und damit nicht reaktiv.
Das entstehende Hydrazon ist stabil und bedarf keiner Reduktion [48, 62]. Die Reaktionsausbeute zwischen Hydrazid und Aldehyd beträgt ca. 80 % [67].
Die Vorteile der gerichteten Immobilisierung über den Kohlenhydratrest der Immunglobuline kommen nicht zum Tragen, wenn auch der Fab-Teil Kohlenhydrate enthält. Dieses ist bei einigen monoklonalen Antikörpern beobachtet worden [65].
Tabelle 1-4 gibt eine Übersicht über die Anwendungen für die gerichtete Immobilisierung von Antikörpern in der Literatur.
| Aktivierung | Matrix | Analyt | Antikörper | Quelle |
|---|---|---|---|---|
| Protein A | Controlled Pore Glass | Human-IgG | polyklonal | [88] |
| Protein A | Agarose | Adenosindeaminase | monoklonal | [87] |
| - | - | Membranproteine | monoklonal | [89] |
| Malein säureimid | Agarose | Maus-IgG | Fragmente | [69] |
| - | - | - | - | [84] |
| Hydrazid | synthetisches Polymer | Human-IgG | polyklonal | [62] |
| - | - | Maus-IgG | polyklonal | [62] |
| Hydrazid | Agarose | Humanplasmaproteine | monoklonal | [65] |
| - | - | BSA | polyklonal | [84] |
| - | - | Humanserumalbumin | polyklonal | [84] |
| - | - | Virusproteine | monoklonal | [67] |
| - | - | Human-IgG | polyklonal | [92] |
| - | - | BSA | polyklonal | [64] |
| - | - | BSA | polyklonal | [93] |
| - | - | Human-IgG | polyklonal | [94] |
| - | - | Maus-IgG | polyklonal | [69] |
| - | - | Penicillin G | polyklonal | [79] |
| Hydrazid | Cellulose | Ovalbumin | polyklonal | [95] |
Die Dissertation wurde am 28. Juni 1996 vom Fachbereich Naturwissenschaften II (Chemie/Biologie) der Bergischen Universität-Gesamthochschule Wuppertal angenommen.
, , letzte Aktualisierung: 09.12.2010
http://www.pdeleuw.de/diss/analytik.html - ausgedruckt am 04.02.2012
