Peter de Leuw:
Gewinnung und Einsatz multispezifischer Antikörper als Hilfsmittel zur Probenvorbereitung in der Rückstandsanalytik von Penicillinen
Penicilline sind mit einer relativen Molmasse von ungefähr 300 zu klein, um von einem Immunsystem erkannt zu werden und eine Immunantwort auszulösen. Andererseits können sie als Haptene von entsprechenden Antikörpern gebunden werden. Um Haptene mit immunogenen Eigenschaften auszustatten, koppelt man sie an Proteine oder andere Makromoleküle. Als Trägerprotein (in der Literatur häufig als "carrier" bezeichnet) werden z.B. keyhole limpet hemocyanin (KLH, das Hämocyanin einer marinen Napfschnecke), bovines Serumalbumin (BSA) [57, 59], humanes Serumalbumin (HSA) [53] oder Ovalbumin (OVA) [96] eingesetzt. Bei einer direkten Verknüpfung von Hapten und Trägerprotein wird das Hapten vom Immunsystem nur schlecht erkannt. Daher wird oft zwischen Hapten und Protein ein Spacermolekül eingesetzt. Die Struktur des Hapten-Protein-Konjugates bestimmt, welches Epitop des Haptens nach außen gerichtet und für das Immunsystem zugänglich ist. Sie bestimmt daher die resultierende Spezifität der Antikörper.
Meistens wird von der Aufgabenstellung ein hochspezifischer Antikörper mit Spezifität für eine Verbindung und minimaler Kreuzreaktivität zu verwandten Substanzen verlangt. Will man jedoch strukturverwandte Metaboliten miterfassen oder eine Substanzfamilie analysieren, so wird ein Antikörper benötigt, der eine geringere Spezifität und eine stärkere Kreuzreaktivität zu strukturverwandten Substanzen besitzt [97].
In der Literatur werden verschiedene Konzepte für die Synthese von Immunogenen dargestellt, mit denen sich Antikörper gegen Penicilline gewinnen lassen. Eine klassische Methode ist die Kopplung von beta-Lactamen bei leicht alkalischem pH-Wert [98, 99] oder bei leicht saurem pH-Wert [98] unter Ringöffnung an ein Trägerprotein. Damit wird ein Immunogen gebildet, das auch in vivo bei Penicillin-Applikation sowohl bei Mensch als auch bei Tier für die Ausbildung einer Penicillin-Allergie verantwortlich ist. Die antigene Determinante ist die Penicilloylgruppe [99].
Daher wird auch die Injektion von unverändertem Benzylpenicillin vorgenommen, um zu entsprechenden Antikörpern zu gelangen [100].
Jackman [96] band Benzylpenicillin über die Carboxylfunktion direkt ohne Spacer an die primären Aminofunktionen von Proteinen. Die entstandenen Antikörper besaßen daher eine hohe Spezifität gegen den Benzylrest.
Keppeler [101] nahm eine Azokupplung von derivatisiertem Benzylpenicillin an ein Protein vor. Hierbei sind jedoch die Diazotierung, die im stark sauren Bereich stattfinden muß, und die Azokupplung im Alkalischen wegen der unzureichenden Stbilität der Penicilline kritische Punkte.
Eine weitere Möglichkeit zur Herstellung eines Penicillin-Immunogens ist die Kopplung der Aminofunktion des Ampicillins an die Sulfhydrylgruppen des Trägerproteins mittels eines bifunktionellen Spacers, der einen NHS-Ester sowie Maleinsäureimid als funktionelle Gruppen trägt [102].
Berger [79] erhielt ein Benzylpenicillin-Immunogen, indem er Benzylpenicillin mit
der Carboxylfunktion über das heterobifunktionelle Reagens N-Hydroxysuccinimidyl-4-Azidobenzoat mit Hilfe einer UV-induzierten Reaktion an KLH band.
Märtlbauer et al. koppelten Cloxacillin mit der Carboxylfunktion an humanes Serumalbumin und erhielten Antikörper mit Reaktivität gegen die Isoxazolylpenicilline [53].
Meistens wird ein Hapten an die Carboxyl- oder Aminofunktionen des Trägerproteins gebunden. Die Bindung an Kohlenhydratreste oder die Bildung von Disulfidbrücken ist ebenso denkbar. Typischerweise wird ein Hapten so modifiziert, daß es eine Carboxylfunktion trägt, die an eine Aminogruppe des Proteins gebunden werden kann [97].
Die erforderliche Bindung an die primären Aminofunktionen des Trägerproteins ist über verschiedene Methoden zu knüpfen:
Die Aktivierungsenergie der Nitrenreaktionen ist sehr gering, man kann daher auch bei niedrigen Temperaturen arbeiten [107].
Heute geht man davon aus, daß sich das entstehende Singulett-Arylnitren rasch zu einem reaktionsschwächeren, sehr elektrophilen Intermediat (Azacycloheptatetraen) umlagert, das anschließend mit Aminen reagiert [106, 108, 110] (Abb. 1-10):
Das elektrophile Intermediat reagiert nicht unter CH-Insertion [106]. Ist kein Amin als Reaktionspartner für das Nitren vorhanden, so entsteht Anilin [111].
Die Hauptreaktion ist der nucleophile Angriff durch primäre Amine.
Säugetiere wie Mäuse, Ratten, Kaninchen, Ziege oder Pferd werden im allgemeinen zur Gewinnung von Antikörpern herangezogen. Während Mäuse und Ratten nur geeignet sind, wenn geringe Mengen der Antikörper benötigt werden, ist die aus den größeren Tieren erhaltene Antiserumausbeute normalerweise genügend groß. Bei der Auswahl der Tiere ist ein Kompromiß zu finden zwischen Größe der Tiere, mit der der Aufwand für Haltung und Pflege der Tiere steigt, und der zur Verfügung stehenden Antiserummenge, die mit der Größe der Tiere steigt. Daher werden in den meisten Fällen Kaninchen als Antikörperquelle gewählt, da der Haltungs- und Pflegeaufwand in einem angemessenen Verhältnis zur verfügbaren Antiserummenge steht [59].
Wie bei Säugern ist auch bei Vögeln eine "Leihimmunität" oder "passive Immunität" der Jungtiere bekannt: Während der Embryonalentwicklung und für eine bestimmte Zeit nach der Geburt ist das Immunsystem des Jungtieres noch nicht voll funktionsfähig. Für diese Zeit muß das Tier vor Infektionen geschützt werden, indem es von der Mutter Antikörper erhält [112, 113].
Während bei Säugern die Mutter Antikörper über den Blutkreislauf über die Plazenta sowie über die Milch an die Nachkommen weitergibt, werden bei Vögeln die Immunglobuline im Dotter angereichert. Dabei findet eine Aufkonzentrierung von IgY statt: Im Serum findet man ein Verhältnis von IgY : IgM : IgA = 6 : 1,3 : 0,6 mg/ml vor, im Dotter liegt es bei 25 : < 0,03: < 0,03 mg/ml [112]. Im Eiklar dagegen ist kein IgY nachzuweisen [114]. Eine vergleichbare Selektivität ist auch beim Säuger zu beobachten: Über die Plazentaschranke wird nur IgG transferiert [60].
IgY ist die von Leslie und Clem [115] eingeführte Bezeichnung für die im Dotter wichtigste Immunglobulinklasse (Y für yolk = Dotter). IgY wird wie IgG beim Säuger im Verlauf der Immunreaktion erst in der Sekundärantwort gebildet [57].
Ein Vorteil aviärer Antikörper gegenüber Antikörpern aus Säugern sind die wesentlich höheren Mengen, die im gleichen Zeitraum gewonnen werden können. Schade und Hlinak [112] geben an, daß aus Eidotter die 18-fache Menge an spezifischen Antikörpern verglichen mit Kaninchenserum gewonnen werden können.
Da keine Blutentnahmen notwendig sind, werden die Tiere physisch und psychisch nicht so stark belastet, außerdem ist kein speziell geschultes Personal erforderlich. Dieses ist auch ein Aspekt des Tierschutzes, dem eine immer größere Bedeutung zugemessen wird [112, 116, 117].
In der Struktur und den Eigenschaften gibt es einige Abweichungen zwischen IgG von Säugern und IgY aus Eidotter.
Frühere Ansicht war, daß IgY ein Vorläufer des Säuger-IgA war. Neuere Untersuchungen zeigen jedoch, daß das Säuger-IgE mit dem IgY der Vögel verwandt ist [118]. Beide Antikörperklassen besitzen in der schweren Kette vier konstante und eine variable Domäne. Sowohl IgA als auch IgG hat im Vergleich dazu nur 3 konstante und eine variable Domäne [57, 113, 118]. Die schweren Ketten des IgY sind daher schwerer als die von IgG [118, 119]. Die leichten Ketten sind vom l-Typ [57].
Als dreidimensionale Struktur wurde eine T-Form sowie eine Y-Form (ähnlich IgG) vorgeschlagen [120]. Die höhere Masse des IgY-Moleküls ist in der Nähe der Scharnier-Region lokalisiert. Dadurch ist die Flexibilität in der Scharnier-Region beim IgY geringer [120, 121]. Bei van Regenmortel [113] findet man, daß IgY keine Scharnier-Region besitzt.
IgY bindet im Gegensatz zu IgG weder an Protein A [50, 57, 112, 113, 122] noch an Protein G [50, 120].
In Tabelle 1-5 sind die strukturellen Unterschiede zwischen IgY und IgG zusammengefaßt.
Tab. 1-5: Unterschiede zwischen Immunglobulin G und Immunglobulin Y
| IgY | Quelle | IgG | Quelle | |
|---|---|---|---|---|
| Extinktionskoeffizient (280 nm, 1 %, in 0,3 M KCl) | 13,2 | [115] | 15,2 | [115] |
| Kohlenhydratanteil | 2,2 % | [115] | 0,8 % | [115] |
| 5 - 8 % | [57] | 3 % | [57] | |
| Molgewicht | 160.000 | [123] | 160.000 | [59] |
| 165.000 | [124] | 150.000 | [75] | |
| 170.000 | [57, 115] | |||
| 180.000 | [125] | |||
| 163 - 206.000 | [126] | |||
| Molgewicht (leichte Kette) | 22.000 | [115] | 20 - 25.000 | [57] |
| 30.000 | [125] | 25.000 | [59] | |
| Molgewicht (schwere Kette) | 67.500 | [115] | 50.000 | [57] |
| 67.000 | [57, 113, 125] | 55.000 | [59] | |
| konst. Domänen (schwere Kette) | 4 | [57, 113, 118] | 3 | [57, 113, 118] |
| pI | 5,2 - 5,7 | [126] | 5,8 - 7,3 | [58] |
| 6 - 8 | [138] |
IgY-Antikörper sind gegenüber Hitze und Säure etwas unstabiler als Säuger-IgG:
Bei 30 Minuten bei 70 °C verliert IgY 50 %, bei 10 Minuten bei 80 °C bereits 90 % seiner Aktivität, während IgG noch stabil ist [119].
Shimizu et al. [121] ermittelten Aktivitätsverluste von IgY nach 15 Minuten bei 70 °C, bei IgG erst bei 15 min bei 75 - 80 °C.
Unterhalb pH 4 verliert IgY 60 % seiner Aktivität, IgG nur 10 % [119].
Die Stabilität im Alkalischen ist bei beiden Antikörperklassen vergleichbar [121].
Die Lagerdauer ist jedoch weder bei IgY noch bei IgG problematisch. Larsson et al.
geben eine Haltbarkeit von IgY von 10 Jahren bei 4 °C, von 6 Monaten bei Raumtemperatur und einem Monat bei 37 °C und von affinitätsgereinigten IgY von mindestens 5 Jahren bei 4 °C an. In welcher Form die Antikörper vorlagen (gefriergetrocknet oder in Lösung), wird jedoch nicht angegeben [122].
Die Stabilitätsunterschiede werden mit den Strukturunterschieden erklärt: IgG enthält im Gegensatz zu IgY eine zusatzliche Disulfidbrücke zwischen der variablen und der konstanten Domäne der leichten Kette. Außerdem ist die beta-Faltblattstruktur in der Scharnier-Region bei IgY nur 30 Aminosäuren groß, während sie bei IgG 215 - 229 Aminosäuren enthält. Dieses macht IgY in der Scharnierregion unflexibler und wahrscheinlich auch unstabiler [121].
Die Dissertation wurde am 28. Juni 1996 vom Fachbereich Naturwissenschaften II (Chemie/Biologie) der Bergischen Universität-Gesamthochschule Wuppertal angenommen.
, , letzte Aktualisierung: 09.12.2010
http://www.pdeleuw.de/diss/agsyn.html - ausgedruckt am 24.05.2013
